Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Comece com células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou suspensão de hiPSC em meio. Adicione um par de nuclease efetora semelhante a um ativador de transcrição ou plasmídeos codificadores de TALEN. Suplemento com um plasmídeo doador contendo um gene de proteína fluorescente, acoplado a um gene de resistência a antibióticos, com braços de homologia adjacentes para alinhamento específico aos loci alvo.

Eletroporar a mistura para gerar poros transitórios nas membranas celulares, permitindo a internalização do plasmídeo. Uma vez dentro das células, os plasmídeos codificadores de TALEN são processados, produzindo TALENs - proteínas quiméricas compostas por um domínio de ligação ao DNA TALE específico do local fundido a um domínio de clivagem de endonuclease de restrição FokI não específico.

Cada monômero TALEN por meio de seu domínio de ligação ao DNA - compreendendo módulos de repetição de aminoácidos em tandem - reconhece e se liga a loci alvo, um módulo por nucleotídeo, em cada fita de DNA em orientações opostas, separadas por uma sequência espaçadora. Os domínios FokI então dimerizam e clivam o DNA dentro da sequência espaçadora, criando quebras de fita dupla com saliências.

Na presença de plasmídeo doador contendo braços de homologia complementares às regiões que flanqueiam o local clivado, o reparo dirigido por homologia ocorre utilizando a sequência homóloga como modelo para a síntese de reparo de DNA para preencher as quebras de fita dupla. Após a ligação dos cortes, a proteína fluorescente intermediária e os genes de resistência a antibióticos são integrados ao genoma do hospedeiro.

Trate os hiPSCs, semeados em uma camada de células alimentadoras para apoiar o crescimento, com meios contendo antibióticos. O gene de resistência a antibióticos sem promotor - impulsionado por um promotor endógeno a montante - facilita a seleção de células editadas por TALEN.

Comece lavando as culturas de iPSC uma vez cada com PBS, depois adicione 1 mililitro de reagente de dissociação celular suave a 37 graus Celsius a cada poço e incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente 5 minutos. Quando mais de 50% das células estiverem dissociadas do vaso de cultura, use uma pipeta P1000 para interromper mecanicamente quaisquer aglomerados de células remanescentes ou células anexadas. Em seguida, adicione 2 mililitros de meio E8 a cada poço e use uma pipeta de 10 mililitros para desagregar ainda mais as culturas em suspensões unicelulares.

Agora, despeje as células colhidas em um tubo cônico de 15 mililitros e gire-as para baixo. Ressuspenda o pellet em uma quantidade mínima de meio E8 para contagem. Então, depois de confirmar a viabilidade das culturas por exclusão de azul de tripano, bem como sua dissociação suficiente, transferir 3 milhões de células para cada um dos dois tubos cônicos de 15 mililitros.

Enquanto as células estão centrifugando, defina o sistema de eletroporação para o programa específico do tipo de célula para a linhagem de células-tronco embrionárias humanas, H9. Em seguida, adicione 10 microgramas do doador de recombinação homóloga sozinho a 1 pellet para a amostra de controle e 10 microgramas do plasmídeo de doador de recombinação homóloga junto com 5 microgramas de cada plasmídeo TALEN para a amostra experimental.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução completa de transfecção de células primárias P3 à temperatura ambiente a cada um dos pellets de controle e experimentais e ressuspenda as células. Transfira as amostras para cubetas individuais e, em seguida, eletropore as amostras. Imediatamente após a transfecção, adicione 500 microlitros de meio E8 à temperatura ambiente a cada cubeta e, em seguida, transfira as amostras de iPSC seccionadas gota a gota para placas individuais de 10 centímetros contendo fibroblastos embrionários de camundongo DR4.