Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Comece com células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou suspensão de hiPSC em meio. Adicione um par de nuclease efetora semelhante a um ativador de transcrição ou plasmídeos codificadores de TALEN. Suplemento com um plasmídeo doador contendo um gene de proteína fluorescente, acoplado a um gene de resistência a antibióticos, com braços de homologia adjacentes para alinhamento específico aos loci alvo.

Eletroporar a mistura para gerar poros transitórios nas membranas celulares, permitindo a internalização do plasmídeo. Uma vez dentro das células, os plasmídeos codificadores de TALEN são processados, produzindo TALENs - proteínas quiméricas compostas por um domínio de ligação ao DNA TALE específico do local fundido a um domínio de clivagem de endonuclease de restrição FokI não específico.

Cada monômero TALEN por meio de seu domínio de ligação ao DNA - compreendendo módulos de repetição de aminoácidos em tandem - reconhece e se liga a loci alvo, um módulo por nucleotídeo, em cada fita de DNA em orientações opostas, separadas por uma sequência espaçadora. Os domínios FokI então dimerizam e clivam o DNA dentro da sequência espaçadora, criando quebras de fita dupla com saliências