PCR digital baseado em chip para detectar variantes raras de transcrição usando um chip nanofluídico

A técnica de PCR digital baseada em chip particiona uma única reação nas câmaras de um chip nanofluídico. A amplificação das sequências particionadas permite a detecção de variantes raras de transcrição - transcritos não canônicos que ocorrem em baixa frequência.

Para começar, pegue uma amostra contendo cDNA da variante rara alvo do transcrito e da variante comum. Adicione uma solução contendo DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers.

Adicione sondas de oligonucleotídeos específicas para variantes de transcrição comuns e raras - marcadas com diferentes repórteres fluorescentes e moléculas de têmpera. O extintor absorve a fluorescência do repórter quando está próximo.

Carregue a mistura no chip nanofluídico. A solução é dividida em nanocâmaras de tamanho uniforme. Cada câmara contendo um cDNA serve como um recipiente de reação independente.

Inicie o processo de ciclagem térmica. Uma alta temperatura de desnaturação separa o DNA de fita dupla em fitas simples. Abaixe a temperatura, permitindo que os primers e as sondas de oligonucleotídeos recozentem para as regiões complementares nas fitas de DNA individuais.

Aumente a temperatura para atingir a etapa de extensão, onde a DNA polimerase estende o primer e cliva a sonda. A distância do extintor permite a emissão de fluorescência do repórter. Leia o sinal de fluorescência.

Crie um gráfico de dispersão representando as câmaras com o alvo de transcrição rara amplificado e as câmaras desprovidas do alvo. Sinais positivos para o alvo indicam a presença da variante de transcrição rara na amostra.

Para começar, deixe a mistura principal e o ensaio descongelar em temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Em seguida, carregue tubos de 0,5 mililitro com alíquotas de 6 microlitros das amostras de cDNA. Além disso, faça um tubo de controle sem modelo. Em seguida, subtraia suavemente a mistura principal e alíquota de 8,7 microlitros por reação em um tubo estéril.

Em seguida, para cada reação, adicione 0,87 microlitros do primer de ensaio personalizado e adicione 1,83 microlitros de água livre de nuclease. Misture a combinação delicadamente e transfira 11,4 microlitros para cada tubo contendo cDNA e para o controle sem molde. Em seguida, misture os tubos suavemente e agrupe o conteúdo do tubo usando centrifugação por pulso. Para obter os melhores resultados, carregue os chips o mais rápido possível.

Conecte o carregador de chips e espere até que a luz indicadora fique verde. Em seguida, prepare a seringa de fluido de imersão puxando suavemente o êmbolo para 1 a 2 milímetros, em seguida, remova a tampa e adicione a ponta.

Em seguida, anote o código escrito na tampa de um novo chip e, em seguida, segure a tampa cuidadosamente ao lado, retire a película protetora e posicione-a no ninho da tampa com o lado adesivo para cima. Agora, pressione a alavanca para abrir o grampo e carregue cuidadosamente o chip no ninho de chips.

Em seguida, coloque uma nova lâmina de carregamento no carregador. Empurre-o suavemente para garantir que esteja firmemente no lugar. Agora, transfira 14,5 microlitros de mistura de reação para a lâmina de carregamento. Não faça bolhas de ar e não desvie a lâmina. Em seguida, pressione o botão preto "Loading" para distribuir o volume no chip.

É importante confirmar se a lâmina de carregamento está no lugar. Em seguida, ao encher a lâmina, não pressione a pipeta até a segunda parada para evitar a introdução de bolhas. Além disso, não desvie a lâmina com a ponta.

Prossiga usando a seringa para transferir cerca de 20 gotas de fluido de imersão para a superfície do chip. Tome cuidado para não tocar na superfície com a ponta e cubra completamente a superfície sem transbordar. Em seguida, gire o braço do rotor para fazer a tampa entrar em contato com o chip e pressione para baixo por 15 segundos. Em seguida, pressione o botão da tampa para liberar o chip e retornar o braço do carregador à sua posição de descanso. Agora, abra o clamp e segure o chip montado em um ângulo de 45 graus para dispensar cuidadosamente o fluido de imersão através da porta de enchimento por meio de uma seringa. Em seguida, gire o chip levemente para remover as bolhas de ar e, em seguida, remova o excesso de fluido com o lenço estéril.

Evite derramar fluido de imersão na borda da ponta. Se isso acontecer, remova cuidadosamente o excesso antes de selar.

Por fim, sele a caixa do chip retirando suavemente a etiqueta da tampa e, em seguida, bloqueando a porta de enchimento por pelo menos 5 segundos. Agora, use o chip dentro de duas horas e, até lá, guarde-o no escuro.

Para configurar a reação, abra a tampa e instale os adaptadores em ambos os blocos, mesmo quando um único bloco for usado. Em seguida, coloque um chip nos blocos de amostra e oriente suas portas de enchimento para a frente do termociclador e eleve ligeiramente a porta. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.

Em seguida, coloque a almofada térmica sobre a configuração para cobrir completamente os chips. Em seguida, programe os ciclos, feche a tampa e inicie a reação.

Quando a reação terminar, desligue o termociclador, remova as almofadas térmicas e, em seguida, remova os cavacos. Deixe os chips descongelarem até a temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos no escuro e analise-os dentro de uma hora. Limpe a superfície do cavaco com isopropanol enquanto inspeciona quanto a vazamentos ou outros problemas.

Para salvar os dados, insira um cartão de memória USB no sistema detector onde os dados podem ser salvos. Em seguida, abra a bandeja de cavacos do sistema detector e carregue o cavaco com a face voltada para cima. Feche a bandeja e aguarde 30 segundos para que os dados sejam processados. Em seguida, remova o chip e repita o processo para o próximo chip.

Em seguida, mova o pendrive do detector para um computador e transfira os arquivos. Abra o software baseado em nuvem e, em seguida, crie um projeto e importe todos os arquivos de dados para os chips de interesse. Em seguida, na guia "Chips definidos", selecione o corante e o ensaio usados. Determine se o chip é aceitável visualizando-o na guia "Revisar dados". Se a amostra foi bem carregada, pelo menos 13.000 pontos devem ser utilizáveis.

Em seguida, observe o gráfico de dispersão do chip selecionado. Lá, aplique um limite definido pelo tipo de ensaio. Para o sinal de corante repórter de amiita de fluoresceína, use um limite de 6.000. Agora, remova quaisquer sinais duvidosos que possam resultar em falsos positivos. Selecione o ponto questionável no gráfico de dispersão usando a ferramenta "Lasso" e selecione a opção "Indeterminado".

Todos os pontos positivos restantes indicam a presença de cópias de cDNA do alvo raro analisado.