PCR digital baseado em chip para detectar variantes raras de transcrição usando um chip nanofluídico

A técnica de PCR digital baseada em chip particiona uma única reação nas câmaras de um chip nanofluídico. A amplificação das sequências particionadas permite a detecção de variantes raras de transcrição - transcritos não canônicos que ocorrem em baixa frequência.

Para começar, pegue uma amostra contendo cDNA da variante rara alvo do transcrito e da variante comum. Adicione uma solução contendo DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers.

Adicione sondas de oligonucleotídeos específicas para variantes de transcrição comuns e raras - marcadas com diferentes repórteres fluorescentes e moléculas de têmpera. O extintor absorve a fluorescência do repórter quando está próximo.

Carregue a mistura no chip nanofluídico. A solução é dividida em nanocâmaras de tamanho uniforme. Cada câmara contendo um cDNA serve como um recipiente de reação independente.

Inicie o processo de ciclagem térmica. Uma alta temperatura de desnaturação separa o DNA de fita dupla em fitas simples. Abaixe a temperatura, permitindo que os primers e as sondas de oligonucleotídeos recozentem para as regiões complementares nas fitas de DNA individuais.

Aumente a temperatura para atingir a etapa de extensão, onde a DNA pol