Analisando o efeito de preparações de produtos de tabaco na produção de citocinas por meio de coloração intracelular e citometria de fluxo

Após a interação com estimulantes inflamatórios, as células imunes liberam moléculas de sinalização inflamatória - citocinas - para produzir uma resposta imune.

Para analisar o efeito das preparações de produtos de tabaco, TPPs, pegue uma placa de vários poços com concentrações crescentes de TPP. Semeie a placa com células mononucleares do sangue periférico humano, PBMCs contendo células imunológicas.

A nicotina - um agente imunossupressor em TPPs - liga-se aos receptores nicotínicos de acetilcolina, regulando negativamente a produção de citocinas pró-inflamatórias. Essa regulação negativa é dependente da dose, com concentrações mais altas tendo um efeito mais significativo.

Centrifugar para peletar as células e rejeitar o sobrenadante que contém resíduos de TPP.

Ressuspenda as células em um meio completo e adicione uma mistura contendo lipopolissacarídeo - um estimulador imunológico e GolgiPlug - um inibidor do transporte de proteínas.

As moléculas de lipopolissacarídeos interagem com células imunes contendo o receptor toll-like 4, desencadeando vias de sinalização intracelular e a produção de citocinas pró-inflamatórias. Enquanto isso, as moléculas do GolgiPlug bloqueiam a secreção de citocinas do aparelho de Golgi, permitindo seu acúmulo.

Fixe as células com uma solução fixadora e permeabilize-as com um agente formador de poros. Cubra as células com um coquetel de anticorpos anticitocinas marcados com fluoróforo, que entram pelos poros e se ligam às respectivas citocinas intracelulares.

Analise as células coradas por citometria de fluxo, que mede os sinais de fluorescência.

Determine o nível de produção de citocinas; uma redução dependente da dose indica o efeito imunossupressor das TPPs.

Antes de iniciar o procedimento de coloração, dilua todo o meio condicionado com fumaça e nicotina nas concentrações listadas em meio completo RPMI até um volume total de 100 microlitros por poço em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de PBMCs suspensos em meio completo a uma concentração de 1 vezes 10 às sextas células por poço, para um volume total de 200 microlitros por poço. Em seguida, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

Após três horas, lave as células e aspire o sobrenadante. Em seguida, cubra a placa novamente e bata em vórtice para dissociar os pellets. Lave as células mais duas vezes, uma vez em tampão gelado e outra em meio completo.

Após a segunda lavagem, trate-os com 200 microlitros por poço de meio completo, complementado com GolgiPlug e LPS por 6 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Em seguida, lave as células com tampão gelado e trate-as com 100 microlitros de Cytofix por poço a 4 graus Celsius. Após 20 minutos, lave as células três vezes com permwash gelado.

Em seguida, adicione 45 microlitros de Cytoperm a cada poço, seguidos de 5 microlitros de cada um dos anticorpos listados. Após 30 minutos a 4 graus Celsius, lave as células três vezes e fixe-as em 200 microlitros de paraformaldeído a 2% gelado. Em seguida, transfira as células para tubos de 12 por 75 milímetros e analise as amostras em um citômetro de fluxo.