Geração de partículas semelhantes ao vírus Chikungunya usando o sistema de expressão de baculovírus em células de insetos

Partículas semelhantes ao vírus Chikungunya, VLPs, são estruturas não infecciosas compostas de proteínas do envelope viral embutidas em uma bicamada lipídica e desprovidas de material genético.

Para produzir VLPs Chikungunya, infecte células de insetos Spodoptera frugiperda Sf9 com baculovírus recombinantes expressando um de genes estruturais Chikungunya. O consiste em um promotor de baculovírus fundido com genes estruturais chikungunya que codificam o capsídeo e as proteínas do envelope.

Durante a incubação, as glicoproteínas do envelope do baculovírus se ligam aos receptores de superfície nas células do inseto. Isso facilita a entrada do baculovírus e a liberação de DNA viral no citoplasma, gerando poliproteínas contendo proteínas do capsídeo e do envelope da chikungunya.

A clivagem autocatalítica pós-síntese da proteína do capsídeo produz a poliproteína precursora que possui proteínas de envelope no retículo endoplasmático, ER. No lúmen do RE, as enzimas clivam a poliproteína precursora, gerando proteínas individuais que entram no compartimento de Golgi para processamento posterior, formando heterotrímeros de proteínas.

As proteases residentes em Golgi clivam os heterotrímeros de proteínas, produzindo proteínas de envelope maduras com proteínas E2 e E1. Essas proteínas do envelope se translocam para a membrana, brotando em VLPs e liberando no meio.

Transfira a cultura infectada para um tubo e centrifugue para peletar as células do inseto. Aspire o sobrenadante contendo VLP e filtre-o para remover os detritos.

O filtrado resultante, contendo VLPs de chikungunya, está pronto para estudos de imunopatologia.

Cultura previamente preparada Spodoptera frugiperda, ou células Sf9, em suspensão em frascos giratórios, agitando continuamente a 130 rpm em um sistema de placa de agitação multiponto. Manter os volumes de cultura não superiores a metade do volume do balão giratório para uma correcta arejamento. Em seguida, expresse as VLPs CHIK infectando 250 mililitros de células Sf9 em um frasco giratório a uma densidade de 2 x 10⁶ células por mililitro com baculovírus recombinante previamente preparado e retorne as células a uma incubadora de 28 graus Celsius.

Use a exclusão de azul de tripano para determinar se a viabilidade celular diminuiu para 70% a 80%. Após a confirmação, transfira as culturas diretamente da suspensão para tubos cônicos de 50 mililitros e gire as células para baixo. Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de poros de 0,22 mícron antes da sedimentação.