Detecção de ligação de vitronectina a superfícies bacterianas usando citometria de fluxo

Tomar tubos de citómetro de fluxo contendo estirpes selvagens e mutantes de Haemophilus influenzae, tipo f.

Pipetar um tampão contendo proteínas bloqueadoras e vitronectina. Incubar.

As proteínas bloqueadoras reduzem as interações inespecíficas na superfície bacteriana, enquanto as moléculas de vitronectina se ligam à proteína H, uma proteína de ligação à vitronectina, em superfícies bacterianas do tipo selvagem. Na cepa mutante, a vitronectina não se liga devido à ausência da proteína H.

centrifuga. Remova a vitronectina não ligada e as proteínas bloqueadoras.

Adicione um tampão contendo anticorpos anti-vitronectina primários, que se ligam especificamente à vitronectina ligada às superfícies bacterianas do tipo selvagem.

Em seguida, introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo, que se ligam aos anticorpos primários da vitronectina e facilitam a detecção da vitronectina.

centrifuga. Remova os anticorpos secundários não ligados. Ressuspenda as bactérias no tampão.

Realize citometria de fluxo para determinar a ligação da vitronectina à superfície bacteriana.

Compare os sinais de fluorescência de cepas selvagens e mutantes. Uma mudança no sinal de fluorescência em bactér