Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
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Tomar tubos de citómetro de fluxo contendo estirpes selvagens e mutantes de Haemophilus influenzae, tipo f.
Pipetar um tampão contendo proteínas bloqueadoras e vitronectina. Incubar.
As proteínas bloqueadoras reduzem as interações inespecíficas na superfície bacteriana, enquanto as moléculas de vitronectina se ligam à proteína H, uma proteína de ligação à vitronectina, em superfícies bacterianas do tipo selvagem. Na cepa mutante, a vitronectina não se liga devido à ausência da proteína H.
centrifuga. Remova a vitronectina não ligada e as proteínas bloqueadoras.
Adicione um tampão contendo anticorpos anti-vitronectina primários, que se ligam especificamente à vitronectina ligada às superfícies bacterianas do tipo selvagem.
Em seguida, introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo, que se ligam aos anticorpos primários da vitronectina e facilitam a detecção da vitronectina.
centrifuga. Remova os anticorpos secundários não ligados. Ressuspenda as bactérias no tampão.
Realize citometria de fluxo para determinar a ligação da vitronectina à superfície bacteriana.
Compare os sinais de fluorescência de cepas selvagens e mutantes. Uma mudança no sinal de fluorescência em bactérias do tipo selvagem confirma a ligação da vitronectina à superfície bacteriana.
Para se preparar para a citometria de fluxo, ressuspenda os grânulos bacterianos com 50 microlitros de tampão de bloqueio contendo 250 nanomolares de vitronectina. Em seguida, incube as amostras por 1 hora em temperatura ambiente sem agitar. Após a incubação, pulverizar as bactérias por centrifugação a 3.500 x g por 5 minutos. Em seguida, lave os pellets três vezes usando PBS e etapas de centrifugação semelhantes.
Após a lavagem, adicione 50 microlitros de anticorpos policlonais primários de ovina anti-vitronectina humana ao pellet bacteriano, em uma diluição de 1 a 100 em PBS / BSA. Incubar a suspensão durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave as bactérias três vezes com PBS para remover os anticorpos não ligados.
Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS / BSA contendo anticorpos policlonais anti-ovinos conjugados com isotiocianato de fluoresceína ao pellet. Incube em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. Finalmente, após três etapas de lavagem, ressuspenda o pellet bacteriano com 300 microlitros de PBS e analise por citometria de fluxo.