Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um tecido como uma matriz de colágeno tridimensional para estudar a função celular. Isso é feito extraindo primeiro o colágeno dos tendões da cauda do rato. Em seguida, as fibras de colágeno são reconstituídas na presença de fibroblastos para permitir que os fibroblastos contraiam o gel de colágeno.

Na terceira etapa, as células tumorais são assentadas no topo da matriz na etapa final. A matriz é incubada no topo de uma grade de metal para criar uma interface ar-líquido para permitir a invasão das células tumorais na matriz. Em última análise, a coloração imuno-histoquímica e a microscopia de fluorescência podem ser realizadas para analisar a migração celular da síntese da matriz, incluindo a invasão de células tumorais e as interações entre diferentes tipos de células.

Portanto, este método é ideal para observar a invasão e a metástase, e também o desenvolvimento do tumor. Em um S tridimensional complexo, podemos olhar para coisas como diferenciação, sobrevivência celular e crescimento celular. Mas, em particular, podemos observar como as células tumorais interagem com o estroma durante os principais eventos de invasão.

Uma das primeiras partes da própria metástase do câncer Para estabelecer culturas de fibroblastos a partir de implantes de pele. Primeiro coloque algumas gotas de MEM suplementadas com penicilina, estreptomicina e zona de fungos no fundo de uma placa de Petri. Em seguida, coloque biópsias de punção de quatro milímetros adquiridas de um antebraço humano no prato.

Em seguida, finalmente, corte a biópsia em pequenos pedaços, balançando uma lâmina de bisturi número 24 contra o fundo da placa de Petri. Coloque a pasta de tecido em um balão de cultura de tecido quadrado de 25 centímetros. Em seguida, despeje o meio de crescimento primário de fibroblastos sobre o tecido.

Isso é suficiente para cobrir a superfície do frasco, mas isso é insuficiente para que o tecido flutue. Incube o frasco por três dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e, em seguida, adicione três mililitros de meio de crescimento de fibra primária após mais três dias. Incubação. Troque o meio com meio de crescimento de fibrablasto primário fresco.

Se as células forem quase confluentes, elas podem ser divididas de um a quatro em novos frascos com meios frescos. Comece lavando as caudas de rato em etanol a 70% e resfrie uma garrafa de ácido acético 0,5 molar a quatro graus Celsius para remover os tendões das caudas de rato. Primeiro, remova a pele de cada cauda de rato individual.

Em seguida, separe o tendão do núcleo da região proximal da cauda. Finalmente, remova o tendão em direção à região distal da cauda usando uma pinça de dente. Após a remoção dos tendões, adicione 250 mililitros de ácido acético 0,5 molar a um frasco cônico de vidro.

Extraia um grama de tendão por 250 mililitros de ácido mexendo a quatro graus Celsius por 48 horas após a extração do tendão. Centrifugue a solução ácida e tendinosa a 7.500 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o pellet. Em seguida, adicione um volume igual de 10% de peso por volume de NACL ao sobrenadante e mexa por mais 30 a 60 minutos após a segunda etapa de agitação.

Pellet a solução. Desta vez, a 10.000 vezes, G, descartar o sobrenadante e o vermelho dissolver o precipitado em ácido acético molar 0,25 com mais agitação por 24 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, dialise a solução de colágeno contra seis a oito trocas de seis litros de aproximadamente 17,5 milimolares de ácido acético.

Após a diálise, o colágeno é granulado a 30.000 vezes G por 1,5 horas. Finalmente, transfira o supra natin para um frasco estéril e ajuste a concentração de colágeno para cerca de dois miligramas por mililitro com o ácido acético 0,5 milimolar previamente resfriado e, em seguida, mantenha o colágeno no gelo. Primeiro, selecione três frascos T 75 de fibroblastos primários confluentes.

Coloque um recipiente de FCS a quatro graus Celsius para esfriar. Em seguida, adicione 75 mililitros do colágeno de cauda de rato previamente preparado em uma garrafa estéril pré-resfriada de vidro de 100 mililitros. Em seguida, adicione nove mililitros de 10 XMEM, mexendo a mistura.

Adicione seis mililitros de hidróxido de sódio normal 0,22 diminuindo ao se aproximar do último mililitro. Para garantir que a cor final esteja entre laranja e rosa. A tripsina olha para os fibroblastos e, em seguida, pellet as células a 400 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Durante a centrifugação, monte 36 pratos de plástico de 35 milímetros. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros do FCS pré-resfriado e adicione imediatamente os fibroblastos ao colágeno. Misture e mexa aproximadamente 2,5 mililitros da mistura de fibroblastos de colágeno por prato de 35 milímetros o mais rápido possível.

Evitando bolhas e fixação do colágeno. Coloque os pratos na incubadora por 10 minutos para permitir que o colágeno forme um gel solto e, em seguida, adicione um mililitro de meio de crescimento de fibroblastos a cada prato. Em seguida, retire a matriz de fibroblastos de colágeno das laterais do prato usando uma pipeta e coloque os pratos de volta na incubadora.

No dia seguinte, adicione outro mililitro de meio de crescimento Fiberblast aos pratos. Em seguida, mude a mídia a cada dois dias pelos próximos oito dias. Durante esse tempo, cada matriz de fibroblastos de colágeno deve se contrair de cerca de 3,5 centímetros a cerca de 1,5 centímetros de diâmetro antes de iniciar esta próxima etapa, esterilizar todas as pinças e equipamentos com etanol.

Em seguida, usando uma pinça esterilizada romba, mova suavemente uma matriz contraída para um poço de uma placa de 24 poços, certificando-se de que a matriz não se dobre. Em seguida, selecione um frasco de células a serem estudadas e esfole as células como antes e, em seguida, ressuspenda as células na placa de meio um mililitro da suspensão celular no topo da matriz e coloque a matriz contraída na incubadora até que as células tenham crescido até quase confluir até o topo da matriz. Aproximadamente três a cinco dias após a autoclavagem de grades de aço inoxidável pré-cortadas para a criação de tripés antes do uso, uma grade estéril em um prato de plástico de seis centímetros adiciona meio de crescimento suficiente para cobrir a grade.

Criar a interface ar-líquido é a parte mais delicada deste procedimento. A matriz deve ser colocada na grade e, em seguida, aspirar suavemente esse meio de modo que a matriz ainda esteja parcialmente submersa do fundo e seja alimentada pelo fundo. Isso cria um gradiente quimiotático e permite que as células no topo comecem a invadir a matriz.

O comportamento celular nesta configuração pode então ser avaliado ao longo de 21 dias ou mais. Coloque uma matriz na grade. Em seguida, aspire suavemente o meio até que a parte inferior da matriz esteja em contato, mas não coberta pelo meio.

A interface ar-líquido deve então ser semelhante a essa cena aqui. Em seguida, transfira uma matriz infiltrada para uma superfície plana. Corte a matriz ao meio com um bisturi novo e, em seguida, levante a matriz com o bisturi e transfira-a para 4% de PFA.

Fixe a matriz durante a noite à temperatura ambiente nas duas figuras a seguir, células de adenocarcinoma ductal pancreático ou células P DAC foram colocadas em camadas sobre uma matriz organotípica. Na primeira figura, as células P dac não invasivas podem ser vistas em uma camada no topo da matriz, enquanto nesta segunda figura as células P dac invasivas que se infiltraram na matriz são observadas aqui, um equivalente de pele viva mostrando uma epiderme estratificada em um componente dérmico colágeno contraído por fibroblastos pode ser visto aqui. As células invasivas da DP em verde podem ser vistas interagindo com fibroblastos em vermelho, que promovem a invasão das células PDX na matriz organotípica.

As células invasivas de DP mostradas aqui novamente em verde são visualizadas dentro da matriz de colágeno, que é visualizada usando a geração de segundo harmônico, e mostradas em roxo os locais de degradação da matriz são visíveis como buracos escuros dentro da matriz roxa. Nesta figura C 8 1 61 células de melanoma invadindo um equivalente dérmico colágeno contraído em fibroblastos são mostradas, bem como observando o comportamento dos processos fundamentais de proteínas fluorescentes durante este ensaio. Você também pode usar este asay junto com a coloração imuno-histoquímica para observar os marcadores de proliferação celular e as diferenças na sobrevivência celular, etc.