Name: Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a criar uma matriz de colágeno tridimensional com fibroblastos humanos para estudar migração celular e invasão tumoral. Este método organotípico simula o estroma tecidual e permite análise por microscopia de fluorescência.

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1. Estabelecimento de culturas de fibroblastos a partir de explantes de pele <ol><li> 4 milímetros biópsias do perfurador adquiridos de antebraço humano são colocados em MEM suplementado 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug de estreptomicina / ml e 0,25 ng / ml Fungizone. </li><li> Apare qualquer gordura subcutânea e pique a biópsia em pequenos pedaços por um número de balanço 24 lâmina de bisturi de encontro ao fundo da placa de Petri. </li><li> Slurry lugar o tecido em um frasco de cultura de 25 centímetros de tecido com dois meios de fibroblastos primários de crescimento (MEM suplementado com FCS a 10%, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / ml, e 25 ug / ml de Fungizone) adicionado até que a superfície do balão é cobertos, mas a profundidade de líquido é insuficiente para o tecido a flutuar. </li><li> Seguindo três dias de incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, adicionar 3 ml de meio de crescimento de fibroblastos primários. </li><li> Após mais 3 dias imprensa mudança de incubação com novos meios de crescimento de fibroblastos primários, ou se CELls são quase confluentes podem ser divididas 1:04 em meio fresco. (Fungizone pode ser omitida a partir deste ponto). </li></ol> 2. Fase I - Preparação de colágeno I de caudas de ratos Nota: Protocolo para aproximadamente 12-14 rabos de rato adolescente (frescas ou congeladas) <ol><li> Preparar da cauda de rato, por lavagem em etanol a 70% e remover os tendões da seguinte forma: </li><li> Remover a pele da cauda de rato por corte a meio da cauda a partir de cima para baixo com um. Bisturi e pealing ao longo do comprimento da cauda </li><li> Retire do tendão do núcleo da região proximal da cauda. </li><li> Remover tendão em direção à região distal da cauda evitando a bainha com pinças dentadas. </li><li> Extrair 1 g de tendão / 250 ml de 0,5 M de ácido acético com agitação a 4 ° C durante 48 h. </li><li> Centrifuga-se o extracto (7500 xg) durante 30 minutos e descartar o sedimento. </li><li> Adicionar um volume igual de 10% (w / v) de NaCl ao sobrenadante, e agita-se durante 30-60 min. </li><li centr xg durante minutos deitar fora o sobrenadante e re-dissolver precipitado em m de ac rela por agita horas a c.><li> Dialisar a solução de colagénio contra 6-8 mudanças de 6L ~ 17,5 mM de ácido acético (1 ml de ácido acético glacial por litro de água fria, a mudança 2 x ao dia). </li><li> Centrifugar colagénio dialisada a 30000 xg, durante 1,5 horas. </li><li> Remover o sobrenadante e colocar em frasco estéril. </li><li> Ajustar a concentração de colagénio I a ~ 2 mg / ml utilizando 0,5 mM de ácido acético a 4 ° C. </li></ol> 3. Fase II - Configurando a matriz 3D com fibroblastos incorporados (permitir a contratação de 8 dias). <ol><li> Montar a mistura, utilizando reagentes de frio a 4 ° C em um frasco pré-arrefecida. Mantenha colágeno I no gelo. </li><li> Para um frasco de T75 confluentes de fibroblastos primários (número de células de ~ 1 x 10 6) a utilização: <ul><li> 25 ml de colagénio da cauda de rato (cerca de conc 2mg/ml) </li><li> 3 ml de 10xMEM </li><li> 0,22 M NaOH: primeiro, adicionar 2 ml, em seguida, gota a gota, agitando até o colágeno fica laranja, </li><li> mas não de-rosa (geralmente até 3 ml). Aproximado p H = 7,2. </li><li> Nota: É importante assegurar que o meio / gel permanece neutro ou ligeiramente ácido, como os fibroblastos não irão contrair o gel, se forem expostos a condições, mesmo ligeiramente alcalinas. </li></ul></li><li> Trypsinise os fibroblastos, girar a 400 xg durante 5 minutos e remover o sobrenadante. </li><li> Durante 5 minutos girar acima: Prepare 12 x 35 milímetros pratos de plástico - normalmente atingir 12 pratos de um frasco de fibroblastos / Mix de colágeno. </li><li> Re-suspender fibroblastos em 3 ml FCS e imediatamente adicionar à mistura de colágeno e mexa. </li><li> Placa de aproximadamente 2,5 ml de colagénio / f ibroblastos, por prato tão rapidamente quanto possível. Tente evitar bolhas e definição de colágeno. </li><li> Deixe o colagénio-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO 2 em ar durante 10 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de fibroblastos crescemth meios (DMEM + FCS 10%). </li><li> Separar a matriz de colagénio / f ibroblastos dos lados do prato, usando uma pipeta. </li><li> No dia seguinte: Adicione 1 ml de meio de crescimento de fibroblastos (DMEM + FCS 10%). </li><li> Alterar mídia todos os dias. Permitir colagénio / f ibroblastos matriz para contrair durante aproximadamente 8 dias, até que eles se encaixam em um prato de 24 cavidades (Contracção de ~ 3,5 cm a 1,5 cm de diâmetro, ver Figura 1). </li></ol> Nota: A concentração de colagénio deve ser ajustada de acordo com a aplicação. Quanto mais diluir a solução de colágeno, mais rápido ele será contratado pelos fibroblastos. Ligeiras diferenças na taxa de contracção será experimentada com lotes diferentes de colagénio na mesma concentração. De igual modo, as culturas de fibroblastos diferentes irão contrair os géis de colagénio em taxas diferentes, e os fibroblastos presentes mais, mais rapidamente a taxa de contracção. Concentração de colagénio e densidade de fibroblastos podem, pois, ajustado para modificar a taxa de contracção,ea densidade do final do gel de colagénio. 4. Fase II - chapeamento células de interesse no topo da matriz Nota: Esterilizar todos os fórceps e equipamentos com etanol antes do uso. <ol><li> Utilizando uma pinça sem corte, mova suavemente matriz contratada a 24 bem-prato. Certifique-se que não se dobra. </li><li> Preparar a suspensão de células de interesse em aproximadamente 4 x 10 1 ml 4 ml / placa e após centrifugação (trypsinising, as células de se livrar de tripsina) na parte superior da matriz. O número real de células necessárias irão variar, dependendo do tipo de células utilizado. Médio de células deve ser por meio de crescimento normal das células de interesse. </li><li> Permitir que as células a crescer até à confluência no topo da matriz, a cerca de 3-5 dias. </li></ol> 5. Fase III - A transferência da matriz para uma grade de invasão (aproximadamente 0-21 dias) <ol><li> Corte grades de aço inoxidável para criar um tripé e autoclave antes do uso (ver Figura 2). </li><li> Coloque grade estéril6 prato cm, adicionar o meio de crescimento a um nível acima da grelha (aprox 10.5ml). Matriz lugar na grelha, e aspirar cuidadosamente meios de modo que o fundo da matriz esteja em contacto com os meios, mas não submersa. Isto é referido como a interface ar / líquido, o que cria um gradiente que promove a invasão. Substituir médios a cada dois dias (ver figura 2). </li><li> Vivo de células, utilizando imagiologia contextual células fluorescentes pode ser trabalhada, nesta fase, ou mais cedo. O colágeno fibrilar contratado ou eu posso ser fotografada usando geração de segundo harmônico (SHG, veja a Figura 3). Usando multi-fotão excitação combinada com detecção de campo amplo descobrimos que SHG pode ser trabalhada pelo menos 100 um para a matriz, enquanto que as células que expressam GFP citoplasmático pode ser trabalhada, pelo menos, 200 um de profundidade. </li></ol> Nota: No que diz respeito à quantificação da invasão, o dia em que matricies são colocados sobre as grades define Dia 0. Colocação em grades gera um gradiente de meios de cultura celular que promove int invasão oa matriz. As amostras podem ser visualizados ao longo do próximo 1 - 21 dias (ou mais) para avaliar processos biológicos, tais como invasão, proliferação de sobrevivência, ou diferenciação (Veja a lista de referência). 6. Estágio IV - Fixação <ol><li> Adicionar 5 ml de 4% de PFA em um tubo Falcon. </li><li> Transferir a matriz sobre uma superfície plana. Corte a matriz no meio com um bisturi limpa (como você vai estar manchando a seção transversal), levante a matriz com bisturi e transferência para a PFA 4%, corrigir durante a noite. </li><li> Matrizes organotípicas agora está pronto para manchar com anticorpo / mancha de escolha (veja a Figura 3). </li></ol> 7. Os resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Exemplo de fibroblastos convencionalmente colagénio I. Mistura de fibroblastos e colagénio de cauda de rato separada da placa de petri e deixa-se contraem ao longo de 6-8 dias. Figura 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; Figura 2 progressão ensaio organotípicas. Um esquema, de um conjunto organotípica-se e progressão. B, Exemplo de colagénio / f ibroblastos no topo da matriz de aço inoxidável, rede estéril para criar interface ar / líquido. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Aplicações de ensaio organotípica. A, B não-invasivos e invasivos ductais pancreáticas adenocarcinoma (PDAC) invadindo células ao longo do tempo com a matriz organotípica. C, vivendo equivalente de pele mostrando uma epiderme estratificada em um fibroblasto-contratado componente colágeno dérmico. D, C8161 invadir células de melanoma em um fibroblasto -contratado equivalente dérmica de colágeno. E, a invasão de células PDAC (verde) que interagem e invadindo com fibroblastos (vermelho) dentro da matriz organotípica. F

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Apresentamos aqui um método para a produção de uma matriz de 3-dimensional adequada para estudos de migração celular invasiva 6-8. A matriz é constituída por colagénio tipo 1 fibrilhas, que são contraídas ao longo de um período de vários dias, por fibroblastos humanos primários epidérmicos. O colagénio é obtido por extracção de ácido, não digestão enzimática, o que preserva a reactividade nas extremidades poli-peptídicas e promove a reticulação das fibras de colagénio em agregados maiores mediante neutralização das condições do tampão 9. Isso resulta em um gel reconstituído que mais de perto imita as características de colagénio in vivo e tem consequências importantes para as propriedades invasivas das células cultivadas nos géis. Não importa se fresco ou congelado material de partida é utilizado, mas a utilização de caudas de rato adolescentes é importante porque a ligação cruzada do colagénio é mais lábil em animais jovens. Colágeno I de animais mais jovens é, portanto, mais fácil de extrair e re-constitui wom maior fidelidade. A matriz de colagénio pode ser fixadas e coradas com anticorpos dirigidos contra as células tumorais, quer invasivos ou fibroblastos estromais 2,10 e são altamente úteis para testar a eficácia de fármacos que possam inibir a invasão 5,6. Embora este protocolo sugere a utilização de primários de fibroblastos de pele humana, é viável utilizar fibroblastos primários do outros tipos de tecidos, de acordo com o tipo de tecido sob investigação. Também é possível estabelecer culturas de fibroblastos imortalizados utilizando, incluindo as células que foram transfectadas estavelmente com conjugados de proteínas fluorescentes. Desta forma, ambas as células estromais e de tumor podem ser rotulados de visualizar as interacções célula-célula durante a invasão 11.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367176-500G </td><td> Prepare estoque 0,22 M em água </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> 35 pratos milímetros </td><td> Falcão </td><td> 353001 </td><td> Para a etapa 3,4 </td></tr><tr><td> 60 pratos milímetros </td><td> Falcão </td><td> 353004 </td><td> Para o passo 5,2 </td></tr><tr><td> Primavera fórceps sem corte </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Dentada, não lisa </td></tr><tr><td> Paraformaldeído 16% </td><td> Electron Microscopy Serviços </td><td> 15710 </td><td> Diluir a 4% em PBS antes da utilização </td></tr><tr><td> Telas para cd-1, tamanho 40 mesh </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Grades de aço inoxidável, 5 por pacote </td></tr><tr><td> Tubagem de diálise </td><td> Medicell Internacional </td><td> 7607 2295 </td><td> 12-14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 prato bem </td><td> Falcão </td><td> 353047 </td><td> Para passo 4.1 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> In Vitrogen </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

organotípica colágeno ensaio i: uma plataforma maleável para avaliar comportamento celular em um contexto de 3-dimensional

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

A migração celular é essencial para muitos aspectos da biologia, incluindo o desenvolvimento de cicatrização de feridas, as respostas celulares do sistema imunitário, e as metástases de células tumorais. A migração tem sido estudada em lamelas de vidro, a fim de tornar a dinâmica celular passíveis de investigação por microscopia de luz. No entanto, tornou-se evidente que muitos aspectos da migração de células dependem de características do ambiente local, incluindo a sua elasticidade, a composição de proteína, e do tamanho dos poros, o que não é fielmente representado por dois substratos rígidos dimensionais, tais como vidro e de plástico 1. Além disso, a interacção com outros tipos celulares, incluindo fibroblastos do estroma 2 e 3, as células do sistema imunológico foi demonstrado desempenhar um papel importante na promoção da invasão das células cancerosas. Investigação ao nível molecular tem cada vez demonstrado que a dinâmica molecular, incluindo a resposta ao tratamento com droga, de células idênticas são significativamente diferentes quando comparados <em&gt; In vitro e in vivo 4. Idealmente, seria melhor para estudar a migração de células em seu contexto que ocorre naturalmente em organismos vivos, no entanto isso não é sempre possível. Sistemas de tecidos intermédios de cultura, tais como a matriz de células derivada, matrigel, cultura organotípica (descrito aqui) de explantes de tecidos, Organóides, e xenoenxertos, são, portanto, importantes intermediários experimentais. Estes sistemas aproximados determinados aspectos de um ambiente in vivo, mas são mais passíveis de manipulação experimental, tais como o uso de linhas de células transfectadas estavelmente, regimes de tratamento de drogas, a longo prazo e de alta resolução de imagem. Tais sistemas intermediários são especialmente úteis como provar motivos para validar sondas e estabelecer parâmetros necessários para a imagem da resposta dinâmica de células e repórteres fluorescentes antes de realizar imagens in vivo 5. Como tal, eles podem desempenhar um papel importante na redução da necessidade de experiências com o livinanimais g.

É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

A migração celular é fundamental para muitos aspectos da biologia, incluindo o desenvolvimento, a cicatrização de feridas, as respostas celulares do sistema imunológico e ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma matriz tridimensional de colágeno semelhante a um tecido para estudar a função celular. Isso é realizado primeiramente por meio da extração de colágeno dos tendões da cauda de rato. Em seguida, as fibras de colágeno são reconstituídas na presença de fibroblastos, permitindo que os fibroblastos contraiam o gel de colágeno.No terceiro passo, as células tumorais são colocadas sobre a matriz no passo final. A matriz é incubada sobre uma grade metálica para criar uma interface ar-líquido, permitindo a invasão das células tumorais na matriz. Por fim, podem ser realizadas coloração imunohistoquímica e microscopia de fluorescência para analisar a síntese da matriz, a migração celular, incluindo a invasão das células tumorais e as interações entre diferentes tipos celulares.Portanto, este método é ideal para analisar invasão e metástase, bem como o desenvolvimento tumoral. Em um S tridimensional complexo, podemos observar aspectos como diferenciação, sobrevivência celular e crescimento celular. Mas, em especial, podemos examinar como as células tumorais interagem com o estroma durante eventos-chave da invasão.Uma das primeiras etapas da própria metástase do câncer é estabelecer culturas de fibroblastos a partir de implantes de pele. Primeiro, coloque algumas gotas de MEM suplementado com penicilina, estreptomicina e fungizona no fundo de uma placa de Petri. Em seguida, coloque biópsias de punção de quatro milímetros obtidas de um antebraço humano na placa.Em seguida, finalmente, pique a biópsia em pequenos pedaços movendo uma lâmina de bisturi número 24 contra o fundo da placa de Petri. Coloque a suspensão de tecido em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados. Então, adicione o meio de crescimento para fibroblastos primários sobre o tecido.Isso é suficiente para cobrir a superfície do frasco, mas é insuficiente para que o tecido flutue. Incube o frasco por três dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5%CO2 e, em seguida, adicione três mililitros de meio de crescimento primário para fibroblastos após mais três dias de incubação. Troque o meio por meio de crescimento primário fresco para fibroblastos.Se as células estiverem quase confluentes, elas podem ser repicadas na proporção de 1 para 4 em novos frascos com meio fresco. Comece lavando os rabos de rato em etanol 70%, resfrie um frasco com ácido acético 0,5 molar a quatro graus Celsius para remover os tendões dos rabos de rato. Primeiro, remova a pele de cada rabo de rato individualmente.Em seguida, desprenda o tendão do núcleo da região proximal da cauda. Por fim, remova o tendão em direção à região distal da cauda utilizando pinça dentada. Após a remoção dos tendões, adicione 250 mililitros de ácido acético 0,5 molar a um frasco cônico de vidro.Extraia um grama de tendão por 250 mililitros de ácido, agitando a quatro graus Celsius durante 48 horas após a extração do tendão. Centrifugue a solução de ácido e tendão a 7.500 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o pellet. Em seguida, adicione um volume igual de NaCl 10% peso por volume ao sobrenadante e agite por mais 30 a 60 minutos após o segundo passo de agitação.Centrifugue a solução. Desta vez a 10.000 ×g, descarte o sobrenadante e redissolva o precipitado em ácido acético 0,25 molar, com mais agitação durante 24 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, realize diálise da solução de colágeno contra seis a oito trocas de seis litros de ácido acético aproximadamente 17,5 milimolar.Após a diálise, centrifugue o pellet de colágeno a 30.000 × g durante 1,5 hora. Por fim, transfira o sobrenadante para um frasco estéril e ajuste a concentração de colágeno para cerca de dois miligramas por mililitro com ácido acético 0,5 milimolar previamente resfriado, e então mantenha o colágeno em gelo. Primeiro, selecione três frascos T75 com fibroblastos primários confluentes.Coloque um recipiente de SBF a quatro graus Celsius para resfriar. Em seguida, adicione 75 mililitros da collagenase de cauda de rato previamente preparada em uma garrafa de vidro estéril de 100 mililitros previamente resfriada. Então, adicione nove mililitros de 10 XMEM sob agitação da mistura.Adicione seis mililitros de hidróxido de sódio 0,22 normal, diminuindo a velocidade ao se aproximar do último mililitro. Para garantir que a cor final fique entre laranja e rosa. Incube os olhos com tripsina, trate os fibroblastos e, em seguida, centrifugue as células a 400 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Durante a centrifugação, prepare 36 placas plásticas de 35 milímetros. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de FCS pré-resfriado e adicione imediatamente os fibroblastos ao colágeno. Misture e distribua rapidamente cerca de 2,5 mililitros da mistura de colágeno e fibroblastos por placa de 35 milímetros.Evitando bolhas e a solidificação do colágeno. Coloque as placas no incubador por 10 minutos para permitir que o colágeno forme um gel fraco e, em seguida, adicione um mililitro de meio de crescimento de fibroblastos a cada placa. Em seguida, desprenda a matriz de fibroblastos em colágeno das bordas da placa usando uma pipeta e recoloque as placas no incubador.No dia seguinte, adicione mais um mililitro de meio de crescimento Fiberblast às placas. Em seguida, troque o meio a cada dois dias durante aproximadamente os próximos oito dias. Durante esse período, cada matriz de fibroblastos de colágeno deve contrair-se de cerca de 3,5 centímetros para cerca de 1,5 centímetro de diâmetro. Antes de iniciar o próximo passo, esterilize todas as pinças e equipamentos com etanol.Em seguida, utilizando pinças esterilizadas de ponta romba, mova suavemente uma matriz contrai­da para um poço de uma placa de 24 poços, certificando-se de que a matriz não dobre. A seguir, selecione um frasco de células a serem estudadas, triture as células com espátulas e pelote as células como antes, depois ressuspenda as células em meio e plaque um mililitro da suspensão celular sobre a matriz, e coloque a matriz contrai­da no incubador até que as células tenham crescido quase até a confluência sobre o topo da matriz. Aproximadamente de três a cinco dias após a autoclavação, corte previamente grades de aço inoxidável para a criação de tripés antes do uso; coloque uma grade estéril em uma placa plástica de seis centímetros e adicione quantidade suficiente de meio de crescimento para cobrir a grade.Criar a interface ar-líquido é a parte mais delicada deste procedimento. A matriz deve ser colocada sobre a grade e, em seguida, o meio deve ser suavemente aspirado de forma que a matriz permaneça parcialmente submersa pela parte inferior e seja alimentada a partir da base. Isso cria um gradiente quimiotático e permite que as células na superfície comecem a invadir a matriz.O comportamento celular nessa configuração pode então ser avaliado por 21 dias ou mais. Coloque uma matriz sobre a grade. Em seguida, aspire suavemente o meio até que a parte inferior da matriz entre em contato com o meio, mas não fique coberta por ele.A interface ar-líquido deve então parecer semelhante à cena mostrada aqui. Em seguida, transfira uma matriz infiltrada para uma superfície plana. Corte a matriz ao meio com um escalpelo novo e, em seguida, levante a matriz com o escalpelo e transfira-a para PFA a 4%.Fixe a matriz durante a noite à temperatura ambiente. Nas duas figuras a seguir, células de adenocarcinoma ductal pancreático ou células P DAC foram sobrepostas a uma matriz organotípica. Na primeira figura, podem-se observar células P dac não invasivas em uma camada sobre a matriz, enquanto nesta segunda figura observam-se células P dac invasivas que infiltraram a matriz. Aqui, pode-se ver um equivalente da pele viva mostrando uma epiderme estratificada sobre um componente dérmico colagenoso contraindo fibroblastos. Células PD invasivas em verde podem ser vistas interagindo com fibroblastos em vermelho, os quais promovem a invasão das células PDX na matriz organotípica.As células PD invasivas mostradas aqui novamente em verde são visualizadas dentro da matriz de colágeno, que é obtida por meio da geração de segundo harmônico e exibida em roxo; os locais de degradação da matriz são visíveis como orifícios escuros dentro da matriz roxa. Nesta figura, são mostradas células de melanoma C8161 invadindo um equivalente dérmico colagenoso contratuído por fibroblastos, bem como a análise do comportamento de processos fundamentais de proteínas fluorescentes durante este ensaio. Você também pode utilizar este ensaio em conjunto com coloração imunohistoquímica para analisar marcadores de proliferação celular e diferenças na sobrevivência celular, entre outros.

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