Detecção de proteínas príon anormais no tecido cerebral usando imuno-histoquímica

Pegue um slide com uma seção fixa do cérebro de mamíferos exibindo agregados de proteína de príon mal dobrados.

Tratar a secção com ácido fórmico para reduzir a infecciosidade dos agregados de priões.

Trate com um tampão ácido dentro de uma câmara de pressão hidratada. Um pH ácido e de alto calor quebra as reticulações de proteínas induzidas pela fixação, desmascarando os epítopos antigênicos.

Mergulhe em peróxido de hidrogênio para inativar a peroxidase endógena, evitando manchas de fundo indesejadas.

Coloque a lâmina em uma placa de cobertura e adicione um tampão para manter a hidratação do tecido.

Introduzir uma solução de bloqueio, evitando a ligação de anticorpos não específicos.

Adicionar um anticorpo primário específico aos agregados de priões.

Remova as moléculas de anticorpos não ligadas. Introduza um anticorpo secundário biotinilado que se liga ao anticorpo primário.

Remova as moléculas de anticorpos não ligadas. Adicione uma enzima peroxidase biotinilada complexada com avidina que se liga à biotina no anticorpo secundário.

Adicione um substrato cromogênico, que a peroxidase oxida em um produto colorido.

Usando um microscópio, observe os agregados corados.

Mergulhe cuidadosamente as seções de tecido em ácido fórmico a 98% em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágue as seções em água da torneira por 5 minutos, seguido de enxágue duas vezes em água destilada. Use um recipiente de coloração de aço inoxidável na câmara de pressão cheio de 500 mililitros de água destilada para pré-tratar o tampão citrato 10 milimolar a 98 graus Celsius por 20 minutos.

Para fins de controle de qualidade, coloque uma seção de fita indicadora adesiva de autoclave na cesta para monitorar a temperatura e a pressão. Assim que o alarme indicar que o equipamento atingiu o tempo e a temperatura do programa, mergulhe a cesta com lâminas. Em seguida, inicie o programa na câmara de pressão para definir o ponto dois e registre a pressão inicial e final deste programa.

Para a inactivação da peroxidase endógena, mergulhar o cesto das lâminas que contém as secções da amostra num banho de peróxido de hidrogénio a 3% em metanol durante 30 minutos. Enxágue as seções em água corrente por 5 minutos. Após a drenagem, mergulhe as seções em solução salina tamponada com tris por mais 5 minutos. Para imunodetecção, coloque cada lâmina em um suporte de placa de cobertura disponível comercialmente pré-umedecido com solução salina tamponada com Tris.

Com o lado do tecido voltado para o suporte e as bordas deslizantes coincidindo com os dois pontos inferiores do suporte, certifique-se de evitar bolhas de ar. Segure o conjunto do suporte deslizante entre o polegar e o indicador. Mantenha um dedo em cima da lâmina de amostra e o outro na parte inferior do suporte. Em seguida, coloque o conjunto na galeria do sistema.

Para garantir que o conjunto esteja bem montado, encha o poço entre a lâmina de amostra e o suporte com solução salina tamponada com tris, sem transbordar. A partir deste ponto, certifique-se de que aproximadamente 80 microlitros de solução salina tamponada com Tris devem ser retidos entre o suporte e a lâmina. Não deixe as seções secarem.

Diminua a coloração de fundo antes do tratamento com o anticorpo primário, pré-incubando as amostras de lâminas por 30 minutos com soro normal a 20% da mesma espécie que o hospedeiro do anticorpo secundário em solução salina tamponada com Tris. Sem lavar as seções, aplique 200 microlitros da solução de anticorpo primário diretamente em cada poço do conjunto porta-lâminas e incube por 60 minutos em temperatura ambiente.

Para lavar as seções, encha os poços com solução salina tamponada com tris e aguarde 5 minutos. Repita a lavagem duas vezes. Em seguida, dilua o anticorpo secundário biotinilado na concentração de 1 a 200 em solução salina tamponada com tris com soro de cavalo a 10%.

Repare o volume necessário, dependendo do número de seções a serem tratadas. Aplique 200 microlitros de solução de anticorpos secundários em cada poço do conjunto de porta-lâminas. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, repita a lavagem com solução salina tamponada com Tris.

Para incubação com peroxidase do complexo avidina-biotina, prepare o reagente 30 minutos antes do uso. e aplique 200 microlitros da solução em cada poço do suporte da placa deslizante. Uma vez feito isso, incube o porta-placas por 30 minutos em temperatura ambiente.