Geração de neurônios simpáticos pós-ganglionares a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Pegue uma microplaca revestida com matriz extracelular e adicione células-tronco pluripotentes humanas suspensas em um meio de diferenciação.

O meio contém moléculas de sinalização que influenciam as vias de sinalização celular, direcionando a diferenciação em células progenitoras neurais.

Introduza outro meio de diferenciação contendo moléculas de sinalização que induzem a diferenciação em células da crista neural, ou NCCs, precursores de células neuronais e não neuronais.

Adicione enzimas para romper a matriz, dissociando assim as células.

Lave para neutralizar as enzimas, depois centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os NCCs em um meio esferóide e transfira-os para uma microplaca.

Os fatores de crescimento do meio e as pequenas moléculas induzem a formação de esferóides.

Suplemento com ácido retinóico, que promove a diferenciação em neurônios progenitores simpáticos.

Transfira o esferóide para uma microplaca revestida com proteína de adesão em um meio de maturação do neurônio simpático, causando a ligação do esferóide.

Os fatores de crescimento neural e o ácido retinóico no meio promovem a maturação em neurônios simpáticos pós-ganglionares, que fazem parte do sistema nervoso periférico e regulam os processos involuntários.

Um dia antes da indução da diferenciação, cubra o número apropriado de placas de seis poços com dois mililitros de matriz de membrana basal por poço e armazene as placas a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, aqueça as placas à temperatura ambiente e lave a cultura de células-tronco pluripotentes humanas prontas para dividir duas vezes com PBS fresco por lavagem.

Após a segunda lavagem, trate as células com sete mililitros de EDTA 0,5 milimolar por 15 minutos na incubadora de cultura de células, antes de aspirar as células-tronco pluripotentes humanas flutuantes e transferir as células colhidas para um tubo de 50 mililitros.

Adicione um volume igual de PBS ao tubo para diluir o EDTA e colete as células por centrifugação. Ressuspender o pellet em um mililitro do meio de diferenciação do dia 01. Antes de adicionar um volume apropriado de meio para contagem, dilua as células para uma concentração de 1,25 x 10⁵ células por centímetro quadrado em dois mililitros de meio de diferenciação por poço.

Aspire toda a solução da matriz da membrana basal de cada poço da placa de seis poços previamente preparada. Em seguida, semeie 2 mililitros de células em cada poço e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, alimente as células com 3 mililitros de meio de diferenciação dia 01 por poço.

No segundo dia de diferenciação, alimente as células com três mililitros de meio de diferenciação do segundo a dez dias por poço. Em seguida, alimente as células em dias alternados até o dia 10. Para agregar as células da crista neural em esferóides, no dia 10, lave as células com PBS e adicione dois mililitros de meio de dissociação a cada poço. Após 20 minutos na incubadora de cultura de células, transfira as células flutuantes para um tubo cônico de 50 mililitros e leve o volume de suspensão no tubo para 50 mililitros com PBS fresco.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um volume suficiente de meio esferóide do dia 10 a 14 para contagem. Após a contagem, dilua as células para uma concentração de 5 x 10⁵ células por 500 microlitros usando o meio esferóide do dia 10 a 14 e coloque 500 microlitros de células em cada poço de uma placa de 24 poços de fixação ultrabaixa. Em seguida, retorne as células para a incubadora de cultura de células.

Para induzir uma cultura esferóide mínima, no dia 11 da cultura, alimente os esferoides da crista neural com 500 microlitros adicionais do dia 10 a 14 do meio esferóide por poço. No dia 12, incline a placa para acumular os esferoides em um lado da placa e aspire cuidadosamente o máximo de meio possível de cada poço sem aspirar esferoides. Em seguida, alimente os esferóides com um mililitro de dia 10 a 14 meio esferóide por poço.

Para induzir uma cultura de esferoides expandida no dia 15, alimente os esferoides com 1,5 mililitros de meio esferóide do dia 10 a 14 suplementado com ácido retinóico 0,5 micromolar por poço. Em seguida, devolva os esferoides à incubadora de cultura de células.

Para diferenciação simpática de neurônios no dia 14 ou 28, incline a placa para acumular os esferóides em um lado da placa e aspire cuidadosamente o máximo de meio possível. Alimente as células com um mililitro de meio neurônio simpático.

Para quebrar grandes agregados esferóides em esferóides menores, adicione não mais do que um mililitro de meio por poço e pipete os esferóides cinco a 10 vezes antes de dividir.

E remova o excesso de fibronectina laminina de placas de 24 poços previamente preparadas. Divida a placa um mililitro de esferóides de cada poço na placa de cultura de esferóides de 24 poços entre quatro poços separados da placa de 24 poços recém-revestida. Adicione 250 microlitros de meio de neurônio simpático fresco a cada poço e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, substitua o meio em cada poço por um mililitro de meio neurônio simpático suplementado com ácido retinóico 0,125 micromolar e retorne a placa à incubadora de cultura de células. Após o dia 35, alimente os neurônios substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente em cada poço por meio novo.