Estudando a regeneração de conexões funcionais entre fatias da medula espinhal usando um arranjo de múltiplos eletrodos

Coloque uma matriz de vários eletrodos, ou MEA, em uma placa de Petri sob um estereomicroscópio. O MEA compreende eletrodos dispostos em uma grade com duas zonas separadas.

Adicione uma gota de plasma sanguíneo ao MEA. Coloque duas fatias da medula espinhal obtidas de embriões de ratos, com os lados ventrais voltados um para o outro.

Introduza uma solução de trombina, misture-a com o plasma e incuba. A trombina causa coagulação plasmática, criando um andaime biológico que facilita a adesão das fatias no MEA.

Adicione um meio nutriente e incube sob agitação, promovendo a formação de conexões celulares entre as fatias e causando sua fusão.

Sob o estereomicroscópio, introduza uma lesão cortando as conexões de tecido entre as fatias. Adicione um meio nutriente e incube.

Durante a incubação, os neurônios crescem através da lesão para conectar as fatias.

Usando uma câmara de registro, registre a atividade elétrica de ambas as fatias da medula espinhal para avaliar suas conexões funcionais regeneradas.

Coloque uma placa de Petri com uma matriz de microeletrodos revestida dentro, sob um estereomicroscópio. Coloque a matriz em foco e centralize uma gota de 6 microlitros de plasma de galinha na matriz de eletrodos. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente duas seções da medula espinhal com seus lados ventrais voltados um para o outro na gotícula de plasma.

Em seguida, adicione 8 microlitros de trombina ao redor da gota de plasma de frango. Em seguida, use a ponta da pipeta para misturar e espalhar cuidadosamente a mistura de plasma de frango e trombina. Pouco antes de a mistura de plasma e trombina de frango ficar muito fibrosa e começar a coagular, aspire o excesso de líquido. Em seguida, tampe a placa de Petri e coloque-a em uma câmara umidificada. Coloque a câmara dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por cerca de uma hora.

Após a incubação, adicione cuidadosamente 10 microlitros de meio nutriente à amostra. Tampe a placa de Petri e coloque-a de volta na incubadora por mais 45 minutos. Em seguida, coloque cada um dos conjuntos de cultura de matriz de vários eletrodos em um tubo de rolo e adicione 3 mililitros de meio nutriente. Feche bem a tampa e coloque o tubo do rolo no tambor do rolo. Gire o tambor a 1 a 2 RPM na incubadora a 37 graus Celsius.

Usando uma pinça com ponta de borracha estéril, remova os conjuntos de cultura de matriz de múltiplos eletrodos do tubo do rolo e coloque-os em uma placa de Petri sob um estereomicroscópio. Colocar o tecido em foco e verificar se as duas fatias estão fundidas.

Em seguida, segure o conjunto com firmeza e coloque uma lâmina de bisturi na ranhura da matriz de multieletrodos perto das fatias de tecido. Segure o bisturi na horizontal e, em seguida, levante o cabo do bisturi, mas deixe a lâmina do bisturi ficar na ranhura da matriz de forma que a lâmina role da base às pontas, cortando o tecido que cobre a ranhura. Corte quaisquer conexões de tecido residual com uma ponta de agulha de calibre 25, se necessário. Trabalhe apenas na área dentro da ranhura e não toque nas bordas sensíveis.

Coloque os conjuntos de culturas de matriz de vários eletrodos de volta no tubo do rolo e adicione 3 mililitros de meio nutriente fresco às culturas. Em seguida, coloque o tubo do rolo de volta no tambor do rolo na incubadora a 37 graus Celsius.

Monte um conjunto de cultura de matriz de vários eletrodos em uma câmara de gravação e aplique cerca de 500 microlitros de solução extracelular na matriz. Em seguida, monte o conjunto no microscópio. Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize e, em seguida, registre a atividade espontânea básica de cada um dos eletrodos de detecção de atividade por 10 minutos.