Isolamento de células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongo e diferenciação em células neurais

Pegue células isoladas de um cerebelo de camundongo recém-nascido contendo células-tronco, neurônios e glia.

Adicione microesferas magnéticas revestidas com anticorpos que se ligam a uma glicoproteína de superfície específica para células-tronco.

Centrifugue, remova as esferas não ligadas e ressuspenda as células em um tampão.

Carregue as células em uma coluna de separação colocada em um separador magnético, que retém as células-tronco ligadas a microesferas enquanto outras células fluem.

Adicione um meio neuroesférico para eluir as células e transferi-las para uma microplaca. Incubar para induzir a formação de neuroesferas primárias, colônias auto-renovadoras de células-tronco.

Centrifugue e descarte o meio. Ressuspenda as neuroesferas em um meio contendo enzimas para digerir as proteínas de adesão celular.

Centrifugue e remova as enzimas. Adicione o meio neurosfera e dissocie mecanicamente as células.

Incubar para permitir a proliferação de células-tronco e a formação de neuroesferas secundárias, enquanto as células diferenciadas sem características de células-tronco não proliferam.

Transfira as neuroesferas para um meio de diferenciação e incuba, promovendo a diferenciação em neurônios e glia.

Coloque os tubos da centrífuga no gelo e, em seguida, coe as células dissociadas através de um filtro de células de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Cubra o filtro com 10 mililitros de solução HBSS gelada, para garantir que as células passem pela malha.

Transfira as células filtradas para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a suspensão a 300 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, use um aspirador a vácuo para remover completamente o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet celular em 160 microlitros de tampão de coluna magnética gelado. Adicione 40 microlitros de microesferas anti-prominina-1 à suspensão celular. Em seguida, incube os tubos em uma geladeira por 15 minutos, para permitir que o anticorpo se ligue às células que expressam prominina-1.

Lave as células com 1 a 2 mililitros de tampão de coluna X e centrifugue-as a 300 vezes g por 10 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de coluna X. Coloque as colunas magnéticas no suporte magnético e enxágue-as uma vez com 500 microlitros de tampão X. Aplique a suspensão de células rotulada na coluna e colete o fluxo em tubos novos de 15 mililitros.

Lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão X. Em seguida, remova as colunas do campo magnético e coloque-as em tubos de 1,5 mililitro. Adicione 1 mililitro de meio de cultura e empurre o êmbolo para dentro da coluna para liberar as células marcadas com grânulos de prominina-1.

Para passar as neuroesferas, transfira-as junto com o meio de cultura para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Pulverizar as neuroesferas por centrifugação a 300 vezes g durante 5 minutos e rejeitar o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em 5 mililitros de meio de dissociação com papaína ou solução de tripsina a 0,05% e incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue novamente a suspensão celular. Em seguida, ressuspenda as células em 5 mililitros de meio neurosfera e dissocie-as pipetando-as lentamente para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de pastagem. Plaquear as células em meio de neuroesfera conforme descrito no protocolo de texto e enriquecê-las com neuroesferas secundárias após 7 a 10 dias em cultura conforme descrito anteriormente.