Estudando a excitabilidade de neurônios fluorescentes usando um grampo de patch de célula inteira

Pegue uma fatia coronal de camundongo transfectado imobilizada em uma câmara de gravação perfundida com aCSF.

A fatia contém uma população esparsa de neurônios piramidais expressando uma enzima alvo e uma proteína fluorescente.

Montar uma pipeta de registo composta por uma solução intracelular e um eléctrodo ligado a um amplificador para medir os sinais neuronais.

Identifique microscopicamente a área do tecido alvo e localize um neurônio fluorescente.

Aplique pressão positiva na pipeta para evitar o entupimento e avance-a para o neurônio-alvo.

A pressão positiva causa um leve recuo na membrana neuronal ao contato.

Libere a pressão, formando uma vedação firme entre a membrana e a ponta.

Defina o potencial de retenção em um valor negativo constante para estabilizar o neurônio.

Aplique uma breve pressão negativa para romper a membrana, conectando o citoplasma ao interior da pipeta e estabelecendo uma configuração de célula inteira.

Mude para o modo de pinça de corrente e aplique pulsos de corrente positiva, gerando potenciais de ação indicativos de excitabilidade neuronal.

Transfira uma fatia para a câmara de gravação usando uma pipeta Pasteur ou um pincel pequeno. Segure a fatia com uma harpa e perfunda-a com ACSF a uma taxa de 2 mililitros por minuto. Para corrigir um neurônio GFP-positivo, localize a área de interesse através do microscópio em 10x. Em seguida, encontre uma célula positiva para GFP usando o objetivo de 60x.

Em seguida, encha o eletrodo de registro com solução intracelular. Em seguida, coloque uma pipeta de vidro no porta-pipetas. Depois, coloque a ponta da pipeta no banho e concentre-se na ponta. Assim que a pipeta estiver no banho, aplique pressão positiva através do sistema de controle de contrapressão.

Aproxime-se da célula de interesse sob orientação visual, mantendo a contrapressão na pipeta. Após o aparecimento de uma pequena covinha na superfície da célula, libere a pressão. Neste ponto, uma vedação hermética com uma resistência maior que 1 gigaohm pode ser formada. Caso contrário, aplique uma leve pressão negativa para facilitar.

Enquanto a vedação está sendo formada, traga o grampo de tensão de retenção para 60 milivolts negativos. Uma vez que o selo gigaohm é formado, aplique um pulso de sucção para romper a membrana celular e entrar no modo de célula inteira. Quando estiver no modo de célula inteira, mude do clamp de tensão para o modo de clamp de corrente e comece a gravar.