Registros eletrofisiológicos de neurônios reprogramados em uma fatia de cérebro de camundongo

Pegue uma fatia coronal de camundongo geneticamente modificado imobilizado em uma câmara de gravação perfundida com tampão oxigenado.

A fatia contém a região estriada, que possui interneurônios reprogramados a partir de células precursoras de oligodendrócitos marcadas por um marcador de interneurônio e expressão de proteína fluorescente.

Monte uma pipeta de registo constituída por um eléctrodo imerso numa solução intracelular.

Identifique microscopicamente um interneurônio fluorescente.

Mantenha uma pressão positiva na pipeta e avance-a em direção ao interneurônio alvo, entrando em contato com a membrana.

Aplique pressão negativa para formar uma vedação de alta resistência.

Aplique pulsos de pressão negativa para quebrar a membrana, estabelecendo uma configuração de célula inteira.

Mantenha o potencial de membrana do interneurônio em um valor negativo constante.

Aplique breves correntes incrementais, abrindo os canais iônicos e alterando o potencial de membrana, desencadeando um potencial de ação.

Eventualmente, a membrana retorna ao potencial de repouso.

Observe essas mudanças no potencial de membrana em resposta à injeção atual, indicando maturação neuronal e reprogramação bem-sucedida.

Depois de transferir uma seção de tecido para uma câmara de registro para eletrofisiologia, monte a pipeta de vidro no eletrodo de registro e abaixe-a na solução. Verifique novamente a resistência do eletrodo. Em seguida, aproxime-se lentamente da célula reprogramada com a pipeta, mantendo uma leve pressão positiva no eletrodo para evitar entupir a ponta, e verifique se a célula é positiva para GFP antes de corrigir.

Quando a célula estiver remendada, mantenha a célula em pinça de corrente de menos 60 a menos 70 milivolts e injete correntes de 500 milissegundos de menos 20 a mais 90 picoamperes com incrementos de 10 picoamperes para induzir potenciais de ação. Isso é indicativo de uma maturação neuronal e reprogramação bem-sucedida.