Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a resposta celular à hipóxia em agregados de células encapsuladas em PEG. Na primeira etapa, as células dispersas são infectadas com o vírus marcador e, em seguida, cultivadas em um agitador para permitir a formação de agregados. O próximo pino linear é funcionalizado e o rimer PEG DM é purificado.

Em seguida, os agregados celulares são encapsulados em um hidrogel PEG DM. Finalmente, os hidrogéis são cultivados em várias condições de oxigênio enquanto são monitorados fluorescentemente para o sinal do marcador de hipóxia. Em última análise, a localização e a extensão da atividade do fator induzível por hipóxia dentro de agregados encapsulados viáveis de células podem ser visualizadas por meio de microscopia fluorescente simples.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de encapsulamento celular e entrega terapêutica baseada em células, como Onde ocorre a hipóxia em culturas 3D e como ela afeta a sobrevivência e a função celular? As implicações desta técnica se estendem às abordagens de medicina regenerativa e terapia de deficiências hormonais, como diabetes estipêndio, devido ao grande impacto da hipóxia em tecidos agregados e encapsulados. A atividade do fator um induzível por hipóxia demonstrou se correlacionar com grande redução da secreção de insulina das células beta, motivando tentativas de dissociar os ilhós primários e reformá-los em pseudo-ilhós.

Agregados de diâmetro reduzido. Nosso marcador pode indicar atividade de fator induzível por hipóxia com agregados em nível celular dentro de qualquer material encapsulante solto. O PEG foi escolhido como material de cápsula devido às suas propriedades de transferência favoráveis, compatibilidade com citos e facilidade com que pode ser modificado funcionalmente.

Depois de pesar dois gramas de PEG em um frasco de vidro de 40 mililitros a aproximadamente 308 microlitros de metanfetamina, acrílico, anidrido e feche frouxamente o frasco com uma tampa de plástico rígido. Microondas o frasco em alta por dois minutos em um microondas doméstico padrão. Em seguida, usando luvas resistentes ao calor, bata completamente o frasco e leve a solução ao micro-ondas por mais cinco minutos.

Deixe o frasco esfriar o suficiente para ser manuseado e, em seguida, destampe-o enquanto gira o frasco. Misture lentamente em cloreto de metileno, agitando a amostra conforme necessário até que a solução pareça límpida e homogênea. Em seguida, adicione a solução gota a gota a 200 mililitros de éter datil frio agitado para precipitar o PEG dm.

Em seguida, colete o PEG DM por filtração a vácuo e deixe-o secar. Depois que o PEG DM secar, dissolva-o em cerca de 100 a 150 mililitros de água deionizada. Em seguida, dialise a solução contra água deionizada por cinco dias em tubo de diálise com um corte de peso molecular de 1000 Daltons após a diálise.

Eloquente a solução em recipientes apropriados e congele-os a 80 graus Celsius negativos durante a noite. Em seguida, liofilize a solução por quatro dias para gerar um pó de PEG DM branco purificado para liberar as células da superfície do frasco de cultura tratada. Primeiro, aspire o meio, enxágue as células com 37 graus CELs de cálcio, HBSS livre de magnésio e aspire o HBSS.

Agora adicione dois mililitros de viagens de 37 graus Celsius e solução de EDTA e deixe as células incubarem a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, bata firmemente na lateral do frasco para liberar as células a oito mililitros de 37 graus Celsius, médio para o frasco e pipetar vigorosamente a suspensão celular para cima e para baixo. Tomando cuidado para não introduzir bolhas.

Depois de transferir a solução celular para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, conte as células por hemocitômetro para determinar o número total de células a serem infectadas. Adicione o volume necessário de suspensão celular para atingir 400.000 células por poço nos poços de uma alíquota de placa de cultura de suspensão de seis poços 50 microlitros de HBSS por poço de células a serem infectadas em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitro. Em seguida, pipete cuidadosamente a quantidade adequada de suspensão de vírus no HBSS preparado.

Agora adicione o volume apropriado de vírus diluído a cada poço para obter o MOI desejado e, em seguida, adicione meio a cada poço para elevar o volume total para 1,7 mililitros. Finalmente, coloque a placa em um agitador orbital Dentro da incubadora, coloque o agitador em uma configuração baixa de cerca de 100 RPM para que o meio lave suavemente ao redor do poço e permita que as células se agreguem por 24 a 36 horas. Comece cortando a ponta cônica de uma seringa de plástico de um mililitro e colocando-a aberta em uma prateleira para criar um recipiente no qual o hidrogel será formado.

Em seguida, pipete 20 microlitros de solução PEG DM fotoativa na extremidade aberta da seringa para o êmbolo, certificando-se de que o volume cubra toda a superfície do êmbolo. Ajuste o êmbolo em pequenos incrementos para obter uma superfície plana e fluida. Agora coloque a pipeta de volta no rack e posicione-o embaixo de uma lâmpada UV por aproximadamente oito minutos para permitir a reticulação do hidrogel.

Durante esse tempo, o volume da pipeta contém o número desejado de células e agregados em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitro. Tampar o tubo e centrifugar as células e os agregados durante cinco minutos a 130 gs. Em seguida, usando um micropipetador, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular na ponta do tubo.

À medida que a cabeça do meio se aproxima do pellet, use uma ponta de pipeta mais fina de 10 microlitros Dispersando uniformemente os agregados celulares por toda a solução precursora de gel, garantindo que estejam totalmente encapsulados. É a parte mais complicada deste procedimento. Ao executar esta etapa, tome cuidado para lixar novamente e transferir o pellet suavemente.

Agora, ressuspenda suavemente o pellet celular em 20 microlitros da solução PEG DM fotoativa. Usando uma ponta de pipeta de boca larga e adicione a suspensão celular à seringa em cima da porção de hidrogel reticulada, exponha a seringa a mais oito minutos de luz UV para completar a construção do hidrogel. Quando terminar, as células devem ser totalmente encapsuladas dentro do hidrogel cilíndrico.

Finalmente, adicione um mililitro de HBSS em um poço de uma placa de 24 poços e um mililitro de mídia em outro. Bem, então ejete o hidrogel da seringa para o HBSS para lavar brevemente o gel. Transfira o gel para o meio e cultive a placa nas condições desejadas.

A qualquer momento durante a cultura, as células podem ser visualizadas usando microscopia fluorescente para rastrear o início do local de sinalização hipóxica, a placa de 24 poços no estágio do microscópio, centralizando o poço com o hidrogel sob a objetiva. O sinal é específico o suficiente para identificar células de sinalização individuais, mas a resolução pode ser inadequada para determinar a localização do sinal intracelular. Nas células de sinalização, o sinal é normalmente observado uniformemente em todo o citoplasma.

Esta figura mostra um exemplo representativo de agregados minx encapsulados em um hidrogel PEG dentro da célula de gel. Os agregados devem ser totalmente fechados na matriz e distribuídos de forma homogênea para permitir um melhor transporte de nutrientes, como visto aqui. Observe como o gel de reticulação é sólido por toda parte, assumindo a forma do vaso no qual a reação foi realizada.

Nesta figura, a sinalização representativa de hipóxia fluorescente em seis células agregadas em um hidrogel PEG DM são mostradas células que foram encapsuladas e depois colocadas em incubação a 20% de oxigênio por 44 horas. A foto à esquerda não exibe sinalização de hipóxia enquanto as células que foram encapsuladas e incubadas em oxigênio a 2% por 44 horas. Conforme ilustrado na tela direita, a hipóxia de sinal onipresente clara também pode ser rastreada em outros tipos de células.

Esta figura mostra a sinalização hipóxica representativa em agregados de células-tronco mesenquimais encapsuladas. Como visto na figura mais à esquerda, o sinal fluorescente não é detectável em 12 horas em 2% de oxigênio, então, como visto na figura central, é mais aparente após 24 horas e 2% de oxigênio. E, finalmente, como visto à direita é altamente expresso após 96 horas e 2%oxigênio Após este procedimento.

Outros métodos como Eliza, análise de proteínas secretadas e ensaios de viabilidade celular podem ser realizados para correlacionar a sinalização hipóxica com o fenótipo celular. Com esse desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de engenharia de tecidos e entrega terapêutica baseada em células explorarem a função de sobrevivência e a diferenciação de células dentro de andaimes e materiais de encapsulamento.