Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

O objetivo geral deste procedimento é preparar um modelo ortotópico de câncer de pâncreas em camundongos que usa imagens de bioluminescência in vivo para monitorar de forma não invasiva o desenvolvimento do tumor. Isso é feito primeiro suspendendo as células cancerígenas marcadas com luciferase em Matrigel. O segundo passo é realizar uma laparotomia para abrir a cavidade abdominal e localizar e proteger o pâncreas.

Em seguida, uma suspensão de células tumorais em matrigel é injetada no pâncreas. A etapa final é substituir o pâncreas e usar suturas para fechar a cavidade abdominal. Em última análise, a imagem de bioluminescência é usada para monitorar a progressão do tumor e rastrear a resposta às intervenções terapêuticas.

A principal vantagem deste modelo sobre ensaios celulares in vitro ou modelos subcutâneos de câncer de pâncreas é que ele realmente nos permite investigar as interações entre as células tumorais pancreáticas e o microambiente pancreático. A cinética da progressão da doença neste modelo é altamente reprodutível e ocorre em um curto espaço de tempo, tornando este modelo útil para o exame de novas terapêuticas no câncer de pâncreas, o que realmente demonstra este modelo é crítico. Como a injeção de células tumorais deve ser realizada com cuidado para evitar vazamentos Para iniciar este procedimento, a cultura.

As células cancerígenas pancreáticas que foram transduzidas para expressar luciferase conforme descrito no protocolo escrito até que sejam 70% confluentes, em seguida, colhem as células com 0,05% de tripsina EDTA e contem-nas usando um hemocitômetro, certifique-se de que a viabilidade seja maior que 90% Em seguida, peletize as células centrifugando suavemente a 200 vezes a gravidade por cinco minutos após a centrifugação, Remova o sobrenadante e ressuspenda as células cancerígenas do pâncreas a 20 milhões de células por mililitro. Em uma mistura de três a dois de matrigel e PBS resfriado, coloque a mistura no gelo. Em seguida, usando uma seringa de insulina de calibre 29 de 0,3 mililitros.

Aspirar a suspensão de células de matrigel preparada para a seringa. Para iniciar este procedimento, anestesie o camundongo usando dois a 3% de isoflurano inalado. Após um a dois minutos, verifique a profundidade da anestesia beliscando suavemente o dedo do pé do mouse para verificar se há falta de reflexo pedal.

Em seguida, aplique lubrificante suficiente em cada olho para evitar a dessecação durante a cirurgia. Em seguida, posicione o mouse de costas em uma almofada de aquecimento de 37 graus Celsius e gire suavemente o mouse para levantar o lado esquerdo do abdômen. Uma vez orientado corretamente, prepare o abdômen do camundongo para a cirurgia.

Usando instrumentos cirúrgicos estéreis, faça uma incisão de 1,5 centímetro através da pele a aproximadamente dois milímetros lateral esquerdo da linha média. Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetro no músculo abdominal subjacente. Em seguida, localize o baço usando uma pinça estéril e remova-o suavemente para a cavidade abdominal.

Prenda o baço ao longo de um cotonete estéril para expor o pâncreas subjacente. Em seguida, localize a cauda do pâncreas adjacente ao baço resus. Suspenda a suspensão de células matrigel e injete 20 microlitros na cauda do pâncreas após a injeção.

Segure a seringa no lugar por 30 a 60 segundos até que o matrigel tenha tempo de solidificar, esta etapa importante minimiza o vazamento celular. Depois que a agulha for removida, inspecione o local da injeção para garantir que não ocorreu vazamento. Em seguida, retorne o baço e o pâncreas para a cavidade abdominal.

Feche a musculatura abdominal do camundongo com uma sutura trançada absorvível de quatro aut com uma agulha redonda usando um ponto contínuo. Em seguida, feche a pele externa com um monofilamento não absorvível. Seis suturas aut com agulha cortante com ponto contínuo e aplicação de Betadine.

Em seguida, remova o camundongo do anestésico inalado e injete entre 0,05 e 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea. Como analgésico pós-operatório, permita que o camundongo se recupere em sua gaiola, colocada em uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius com livre acesso a comida e água. Continue monitorando o mouse de perto nos primeiros dias após a cirurgia.

Se o camundongo demonstrar sinais de dor, como curvatura ou mobilidade reduzida, a buprenorfina pode ser administrada por via subcutânea a cada 12 horas durante um período de 36 horas. Após a cicatrização do local cirúrgico em sete a 10 dias, anestesiar o camundongo e remover as suturas externas. Para iniciar o rastreamento bioluminescente das células cancerígenas do pâncreas.

Anestesiar o mouse novamente usando dois a 3% inalados isof flúor, e colocar lubrificante sobre os olhos para evitar que a secagem morra. Uma vez anestesiado, injete 150 miligramas por quilograma de Lúcifer por meio de injeção na veia da cauda e aguarde de um a dois minutos para que o luciferiano chegue às células. Coloque o mouse do lado direito no sistema de imagem bioluminescente para que o tumor aponte para a câmera.

Aqui estamos usando o sistema de imagem Illumina dois. Em seguida, capture imagens de luz branca e bioluminescência usando o software de imagem, conforme descrito anteriormente em outros artigos JOV. Quando a imagem estiver concluída, remova o camundongo do anestésico inalado e deixe-o se recuperar em sua gaiola doméstica.

Repita essas etapas durante todo o crescimento do tumor para investigar o crescimento do tumor. Cinética. O uso de linhagens celulares marcadas com luciferase fornece uma maneira única de medir o crescimento do tumor. Não invasivamente. Aqui é mostrado um camundongo 10 dias após a injeção com um tumor relativamente pequeno, 31 dias após a injeção em que o tumor aumentou e cinco dias após o tumor ter sido ressecado.

A bioluminescência vista nesta imagem mostra recorrência do tumor pancreático cinco dias após a ressecção, bem como metástase para o fígado próximo. O gráfico mostrado aqui mostra taxas de crescimento semelhantes para o método de injeção de células de matrigel. Descrito neste vídeo comparou outro método em que pedaços de tumor pancreático são transplantados pousou.

Cinética de crescimento semelhante pode ser vista tanto para a panela quanto para a capina. Linhagens celulares após sacrifício, coloração H e d foram realizadas para mostrar a natureza invasiva das células cancerígenas pancreáticas no tecido pancreático circundante mostrado aqui, denotado pelas estrelas amarelas, bem como metástases em outros órgãos, incluindo o fígado mostrado aqui. Uma vez dominado, esse método pode ser feito em cerca de 10 minutos.

Além disso, a visualização biocentrária da progressão metastática e recorrente da doença torna este modelo clinicamente relevante, pois atualmente a maioria das terapias contra o câncer são paliativas.