Língua Eletrônica Geração de padrões contínuos reconhecimento para análise de proteínas

O objetivo geral do experimento a seguir é construir uma língua eletrônica com base em uma abordagem combinatória e realizar imagens de plasma e ressonância de superfície para análise de proteínas. Isso é conseguido usando lactose e lactose sulfatada como blocos de construção e depositando suas misturas na superfície dourada de um prisma para automontagem para criar uma matriz de receptores combinatórios de reação cruzada. Como uma segunda etapa de superfície, são aplicadas imagens de plasma e ressonância, que monitoram eventos de ligação em tempo real e produzem imagens SPR e uma série de curvas de ligação cinética chamadas gramas de sensor.

Em seguida, o processamento de dados é realizado com base nos gramas do sensor usando um software de computação matemática para criar um perfil de evolução contínua 2D e uma paisagem de evolução contínua 3D para cada amostra, os resultados mostram que a língua eletrônica é capaz de gerar paisagens distintas de evolução contínua 3D para proteínas purificadas comuns e é eficiente para sua discriminação com base no reconhecimento de padrões. Esta técnica tem várias vantagens sobre os métodos existentes, como gnose eletrônica clássica e línguas. Primeiro, a preparação dos receptores de canto é amplamente simplificada.

Uma grande diversidade de receptores de reatividade cruzada pode ser optada pela mistura de um pequeno número de moléculas. Em segundo lugar, graças à abordagem combinatória, os padrões de reconhecimento gerados por nossa língua eletrônica podem ser considerados contínuos, de modo que sinais anormais podem ser mais facilmente identificados. Portanto, uma análise mais confiável pode ser obtida para preparar a matriz combinatória de receptores de reatividade cruzada.

Primeiro, limpe a superfície dourada do prisma 48 horas antes de usar com um limpador de plasma por três minutos sob 75% de oxigênio, 25% de argônio, 0.6 milibar e 40 watts de potência. Em seguida, prepare 100 mililitros de solução tampão fosfato contendo 10% de glicerol ou PBSG. A adição de glicerol ao PBS é muito importante para reduzir a evaporação do solvente e as alterações no bloco de construção ou na concentração de BBB após a deposição.

Em seguida, prepare soluções de estoque de lactose ou bloco de construção um e lactose sulfatada, ou bloco de construção dois das soluções de estoque. Prepare 11 soluções puras e mistas com proporções entre zero e 100% em incrementos de 10% e uma concentração total de bloco de construção de 0,1 milimolar em PBSG deposite oito gotículas de nanolitros dessas soluções puras e misturadas na superfície do prisma usando um observador sem contato em duplicata quádrupla para cada proporção com 44 pontos no total, coloque o prisma dentro de uma placa de Petri contendo um mililitro de água ultra pura e deixe-o durante a noite em temperatura ambiente para automontagem de BB um e BB dois na superfície dourada aqui. Supõe-se que a composição média da superfície nas monocamadas mistas automontadas reflita a composição da solução mista de deposição.

No dia seguinte, lave bem o prisma com água ultrapura antes de secá-lo sob um fluxo de Argonne. Defina a incubadora na qual o plasma de superfície e os aparelhos de ressonância colocados a 25 graus Celsius para evitar alterações no índice de refração induzidas pela variação de temperatura durante a detecção de proteínas. Insira um prisma de enxágue não funcionalizado na célula de fluxo de poliéter éter cetona de 10 microlitros conectada a uma bomba de seringa controlada por computador, um desser e uma válvula de injeção de média pressão de seis portas.

Encha o sistema de fluxo com buffer de funcionamento de pilhas recém-filtradas e Degas. Remova o prisma de enxágue e insira o prisma contendo a matriz de receptores de reação cruzada combinacional nas pilhas de fluxo de célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por minuto. Com a ajuda da câmera CCD, remova quaisquer bolhas de ar presentes na superfície do prisma passando pelo buffer de corrida.

Defina rapidamente a área de estudo para cada ponto desenhando um círculo com o mesmo diâmetro para a área de interesse com base em uma imagem bem contrastada da matriz e, com a ajuda de um software integrado no sistema de plasma de superfície e ressonância de imagem, trace curvas de plasma, que representam curvas de refletividade em função do ângulo de incidência para todos os pontos. Escolha o ângulo de trabalho, que é a posição na qual as curvas cinéticas serão registradas na inclinação mais alta das curvas de refletividade. Gire o espelho de varredura para fixar o ângulo de trabalho selecionado para medições cinéticas.

Continue a executar pilhas através do sistema de fluxo até que o sinal de refletividade para todos os pontos esteja estável e constante. Em seguida, use uma seringa para injetar um mililitro de lectina de amendoim ou uma solução de HL no loop de amostra de 500 microlitros com a válvula de injeção na posição de carga com a taxa de fluxo ajustada para 100 microlitros por minuto, coloque a válvula de injeção na posição de injeção. Inicie as medições cinéticas monitorando as variações de refletividade em relação ao tempo simultaneamente em todos os pontos no final da injeção de proteína.

Enxágue a matriz com buffer de execução por oito minutos. Finalmente, injete um mililitro de 1%DS para regenerar a matriz. Repetir o mesmo procedimento para as outras proteínas após a introdução da solução proteica na célula de fluxo.

A ligação molecular ocorre e induz uma mudança das curvas plasmáticas e uma variação da reflexividade. O software de aquisição de imagem converte os valores de intensidade de luz medidos em níveis de escala de cinza, fornecendo imagens SPR e gerando a variação de refletividade versus tempo, fornecendo gramas de sensor. Em seguida, use um software de computação matemática para traçar a refletividade no final de cada injeção de proteína versus a proporção do bloco de construção para gerar um perfil de evolução contínua 2D para cada amostra.

Finalmente, adicione a proporção do bloco de construção nos gramas do sensor para gerar um padrão de reconhecimento contínuo dependente do tempo chamado Uma paisagem de evolução contínua 3D para cada proteína para sondar a capacidade da língua eletrônica para análise de proteínas comuns, três proteínas foram usadas uma mioglobina HL e lisozima para cada proteína. Um perfil de evolução contínua 2D distinto foi gerado pela língua eletrônica, conforme mostrado em 3D. Paisagens de evolução contínua também foram geradas para uma mioglobina HL e lisozima.

A língua eletrônica é sensível às características superficiais das proteínas, como a distribuição de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, neutros e carregados. Os perfis de evolução contínua obtidos das paisagens podem ser usados como impressões digitais para discriminação eficiente de proteínas e identificação prospectiva com base no reconhecimento de padrões. Ao tentar essa abordagem, é importante lembrar de seguir os procedimentos experimentais otimizados e padronizados para garantir uma boa reprodutibilidade da língua eletrônica.

Esses procedimentos incluem uma superfície limpa e boa do prisma, a escolha do ângulo de trabalho para a ressonância plasmática de superfície e a aplicação da solução apropriada para regenerar completamente o sistema para reutilização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir a língua eletrônica com base na abordagem COMBINATOR e na ressonância de plasma SOFA para análise de proteínas. Boa sorte para seus experimentos.