小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

本实验的总体目标是从小鼠成纤维细胞生成真正的诱导滋养层干细胞（iTSCs）。该方法有助于回答干细胞领域中的关键问题，即胚胎谱系与胚外谱系之间屏障的本质。该技术的主要优势在于转基因表达仅短暂激活，从而有利于稳定转化细胞的筛选。

在配备适当个人防护装备的生物安全二级实验室中，用5毫升多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）溶液覆盖五块100毫米培养皿，轻轻摇动培养皿使包被液均匀分布。将培养皿放入37°C培养箱中孵育30分钟，随后吸除多聚赖氨酸溶液，并用PBS缓冲液冲洗培养皿一次。接着，在每块培养皿中加入7×10⁶个293T细胞，置于10毫升293T细胞培养基中，轻轻旋转培养皿使细胞均匀分布，然后将培养皿放回培养箱继续培养。

第二天早晨，将生长培养基更换为5 mL转染培养基。然后向培养物中加入6 µL 1000倍浓度的氯喹溶液储备液，并将培养板放回37°C的培养箱中。为制备转染混合物，针对每种慢病毒载体，将600 µL慢病毒载体DNA溶液逐滴加入600 µL 2X HEPES缓冲盐溶液中，同时涡旋混匀，并将转染混合物在室温下孵育。

15分钟后，将混合物逐滴非常小心地加入已准备好的293T细胞中，然后将培养皿放回培养箱。5至6小时后，更换为10毫升病毒生产培养基，并将培养板重新放回培养箱。次日早晨，小心更换为7毫升新鲜的病毒生产培养基，继续过夜培养。

接下来，将每块培养板中的培养基转移至单独的15毫升锥形管中，并向培养板中加入7毫升新鲜的病毒生产培养基，继续孵育过夜。次日早晨，收集第二批含病毒的培养基，将上清液与第一批病毒液合并，然后将含病毒的培养基通过0.45微米无表面活性剂的醋酸纤维素膜过滤器过滤，分装为500微升每管，于-80℃保存。为了将成纤维细胞转化为诱导性滋养层干细胞，用2毫升PBS对转导后的胚胎成纤维细胞（MEFs）清洗两次。

然后在37摄氏度下用0.5毫升胰蛋白酶EDTA溶液消化细胞。三到四分钟后，在倒置显微镜下确认细胞已从培养皿上脱落，随后加入1毫升TS培养基以终止胰蛋白酶反应。将细胞悬液转移至各自的15毫升锥形管中，并离心收集细胞。

然后将沉淀重悬于2毫升TS培养基中，并在含有成纤维细胞生长因子4和肝素、并补充了多西环素的10毫升TS培养基中，每100毫米培养皿接种两次，每次接种5×10⁴个表达mCherry的四因子转导细胞或对照未转导MEF细胞，进行过夜培养。次日，在落射荧光显微镜下，通过mCherry蛋白的表达情况评估转导效率。若转导效率约为100%，则将培养物放回培养箱，并每隔一天更换所有培养皿中的培养基，直至第10天。

此后，使用倒置显微镜监测四因子培养皿中转分化区域的出现情况，持续长达三周，期间用含有成纤维细胞生长因子4和肝素但不含多西环素的新鲜TS培养基喂养细胞。识别转分化区域至关重要，因为此时MEFs在形态上并不类似于滋养层干细胞。应注意寻找紧邻滋养层巨细胞的密集堆积的克隆集落，滋养层巨细胞可通过其细胞大小和大细胞核加以识别。

为了分离单个iTSC细胞系，首先用70%乙醇擦拭倒置显微镜，以尽量减少细菌污染的风险。接着，向96孔U型底培养板的12个孔中各加入40 µL 0.5%胰蛋白酶-EDTA，并将该培养板置于冰上。然后，吸除四因子MEF转分化培养皿中的培养基，并用10 mL PBS清洗细胞一次。

洗涤后，向细胞中加入 10 毫升新鲜 PBS，将培养板置于倒置显微镜载物台上。使用 100 微升移液器并调至 40 微升，用移液器枪头围绕每个单个克隆划圈，吸起悬浮的克隆。将每个克隆转移至 96 孔板的单独孔中，直至挑取 12 个克隆。

然后将菌落于37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，用移液器吹打使细胞解离，并将细胞悬液分别转移至含有500 µL完全TS培养基（含成纤维细胞生长因子和肝素）的24孔板中的各个孔内，进行过夜培养。次日，更换为新鲜的完全TS培养基（含成纤维细胞生长因子和肝素），以去除死细胞，并将培养板放回培养箱中继续培养。

每天监测培养物，观察具有明亮边界的上皮样克隆的出现。一旦观察到克隆，继续培养细胞至多一周，或直至细胞融合度达到70%。在四因子转基因表达被激活的培养物中，细胞形态迅速发生变化。

大约在第14至21天，出现明显的转分化区域。这些初级克隆缺乏典型的滋养层干细胞形态，但在传代培养后，可观察到具有紧密边缘和明亮边界的特征性上皮形态，与真正的滋养层干细胞高度相似。当四种因子诱导产生的滋养层干细胞持续表达滋养层转录因子Cdx2和Tfap2c时，这些细胞系可用于后续的体外或体内分析。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在六周内完成。在完成该操作后，还可采用诸如囊胚辅助注射等其他方法，进一步探究所获得的诱导滋养层干细胞（iTSCs）的嵌合能力。该技术建立后，为相关领域研究人员探索小鼠胚胎与胚外细胞命运转换及早期谱系分离机制开辟了道路。

观看本视频后，您应充分了解如何将新的胚胎成纤维细胞直接转化为诱导性滋养层干细胞。请务必注意，使用慢病毒载体可能具有极高危险性，必须始终遵循生物安全二级相应的操作规程等预防措施。