Demonstração de um microscópio integrado Hyperlens e super resolução imagem
8 de setembro de 2017
O uso de um hyperlens tem sido considerado como uma técnica de imagem de romance Super-resolução devido a suas vantagens na geração de imagens em tempo real e sua implementação simples com fibra óptica convencional. Aqui, apresentamos um protocolo descreve a fabricação e aplicativos de um esférico hyperlens de imagem.
O objetivo geral deste procedimento experimental é demonstrar o processo de fabricação e a imagem subdifrativa do dispositivo hipelente bidimensional. Essa técnica inovadora de imagem com super-resolução apresenta as vantagens de permitir imagem em tempo real e implementação simples em óptica convencional. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de imagem com super-resolução, como a visualização de células vivas e nanopartículas dinâmicas abaixo do limite de fração.
A hiperlente é uma lente esférica especial com estrutura multicamada que possui uma dispersão hiperbólica plana, capaz de amplificar informações de alta frequência e resolver detalhes com resolução semelhante à de ópticas convencionais no campo distante, em tempo real. A principal vantagem da hiperlente esférica é sua capacidade de ampliar informações bidimensionais em frequências visíveis. Uma hiperlente esférica também pode ser facilmente integrada à microscopia convencional, sem a necessidade de sistemas adicionais complexos.
Os responsáveis por demonstrar o procedimento serão Dasol Lee e Inki Kim, alunos de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, aplique o fotoresiste positivo sobre a lâmina de quartzo por centrifugação a 2.000 rpm e aqueça por 60 segundos a 90 graus Celsius. Em seguida, utilize uma máquina de corte para dividir a lâmina com o fotoresiste em pequenos pedaços de 20 por 20 milímetros quadrados.
Sopre as peças com uma pistola de nitrogênio comprimido para remover quaisquer partículas resultantes da etapa de corte. Em seguida, coloque a pastilha cortada em um banho ultrassônico de água desionizada por cinco minutos a 45 graus Celsius. Remova a camada de fotoresina utilizando um banho ultrassônico de acetona por cinco minutos a 45 graus Celsius.
Em seguida, limpe o substrato colocando-o em um banho ultrassônico de álcool isopropílico por cinco minutos a 45 graus Celsius. Seque o substrato com um jato de nitrogênio comprimido. Para gravar o padrão da máscara, carregue primeiro os substratos de quartzo limpos em um sistema de evaporação por feixe de elétrons de alto vácuo.
Deposite a camada de cromo com uma taxa de deposição de dois angstroms por segundo. Pressione o botão de ventilação para ventilar a câmara. Monte uma amostra no suporte de Feixe de Íons Focados ou FIB utilizando fita de cobre condutora.
Em seguida, carregue o suporte de FIB na câmara de FIB. Feche a porta da câmara e pressione o botão de bombeamento para evacuar a câmara. Selecione "Feixe Ligado" na guia de controle de feixe e defina a corrente do feixe de íons e a tensão de aceleração para o modo FIB.
Ligue o sistema de feixe de íons. Selecione "Feixe Ligado" na guia de controle de feixe para ativar o feixe de elétrons e foque a imagem com baixa ampliação usando o software. Em seguida, defina a distância de trabalho como quatro milímetros na guia de navegação no modo de microscopia eletrônica de varredura.
Defina o ângulo de inclinação do suporte em 52 graus e obtenha imagens de MEV em diferentes aumentos antes da fabricação do padrão da máscara com arranjo de furos. Na guia de padronização, selecione a região de padronização e crie um arranjo de furos de 50 nanômetros na camada de cromo. Após concluir, desligue os sistemas de feixe de elétrons e feixe de íons e deixe-os esfriar.
Pressione o botão de ventilação para ventilar a câmara com gás nitrogênio. Em seguida, retire o suporte da câmara. Depois, coloque o substrato padronizado em um a 10 de etchante de óxido tamponado por cinco minutos.
Coloque o substrato padronizado em água desionizada para limpar o gravante de óxido tamponado. Em seguida, seque a amostra com gás nitrogênio comprimido. Coloque o substrato padronizado em gravante de cromo para remover a camada de máscara de cromo.
Por fim, coloque o substrato padronizado em água desionizada durante cinco minutos para limpá-lo. Pressione o botão de ventilação do sistema de evaporação por feixe de elétrons e aguarde até que a ventilação termine. Em seguida, carregue o substrato padronizado em um sistema de evaporação por feixe de elétrons de alto vácuo após a ventilação.
Feche a porta da câmara e evacue a câmara pressionando o botão da bomba. Deposite a camada de prata com uma taxa de crescimento de um angstrom por segundo e deposite uma camada de prata com espessura de 15 nanômetros. Após a deposição da camada de prata, resfrie o substrato por cinco minutos.
Altere o compartimento do sistema de evaporação por feixe de elétrons escolhendo um cadinho diferente e deposite a camada de óxido de titânio com uma taxa de crescimento de um angstrom por segundo. Em seguida, deposite uma camada de óxido de titânio com espessura de 15 nanômetros. Após a deposição da camada de óxido de titânio, resfrie o substrato por cinco minutos.
Repita as etapas de deposição por dezenas de ciclos para depositar uma multicamada de prata e óxido de titânio. Troque o compartimento do sistema de evaporação por feixe de elétrons e deposite a camada de cromo com espessura de 50 nanômetros. Após a deposição da camada de cromo, desligue o sistema de evaporação por feixe de elétrons.
Pressione o botão de ventilação e ventile a câmara introduzindo gás nitrogênio. Após a ventilação, abra a porta da câmara e retire o suporte do montante da câmara. Remova o dispositivo de hiperlente fabricado.
Em seguida, feche a porta da câmara e evacue a câmara pressionando o botão da bomba. Monte o hiperlente depositado com cromo no sistema de usinagem por feixe iônico focado (FIB) e padronize uma estrutura em nanoescala conforme as instruções do fabricante. A seguir, posicione um microscópio óptico convencional do tipo transmissão sobre a mesa óptica.
Conecte uma fonte de luz branca ao caminho de iluminação do microscópio usando um adaptador. Coloque um filtro óptico de passagem de banda centrado em 410 nanômetros. Selecione uma lente objetiva de imersão a óleo com alta magnificação e utilize uma câmera CCD de alta qualidade para obter as imagens.
Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva. Por fim, posicione uma hipelente na platina da amostra e capture as imagens. Aqui é mostrada uma hipelente composta por multicamadas de prata e óxido de titânio depositadas alternadamente.
A imagem em corte transversal mostra que o multilayer de filme fino de prata e óxido de titânio é depositado com espessura uniforme sobre o substrato de quartzo hemisférico. Uma hiperlente composta por prata e óxido de titânio apresenta um excelente desempenho no comprimento de onda de 410 nanômetros porque a relação de dispersão dos multilayers empilhados possui uma curva de dispersão hiperbólica, conforme mostrado aqui. Componentes de vetor de onda com alta frequência espacial podem se propagar ao longo da direção radial da hiperlente.
As pequenas características que possuem componentes de alta frequência, as quais não podem ser capturadas pela óptica convencional, podem propagar-se até o campo distante através da hiperlente, conforme calculado por simulação de elementos finitos. Após a fabricação, a hiperlente pode ser integrada ao sistema convencional de microscopia, conforme mostrado neste simples esquema do sistema de imagem da hiperlente. A hiperlente é colocada sobre a lente objetiva.
Para demonstração do hiperlente, um padrão artificial é gravado na superfície interna do hiperlente. Os resultados mostram as imagens capturadas através do hiperlente. Os tamanhos das lacunas variam de 160 nanômetros a 180 nanômetros em cada caso.
As características subdifrativas são resolvidas e a capacidade de super-resolução da hiperlente pode ser confirmada. O desenvolvimento da hiperlente abriu caminho para a técnica de imagem de super-resolução explorar maquinaria de biomoléculas em escala nanométrica e nanopartículas inorgânicas. Após assistir a este vídeo, você poderá ter um bom entendimento de como fabricar uma hiperlente de alta qualidade e montar seu próprio sistema de imagem de super-resolução.
Espera-se que a técnica de hiperlente seja aprimorada em termos de praticidade mediante a adoção de um método de fabricação escalonável e reprodutível. O hiperlente permitirá que cientistas observem dinâmicas biofísicas que ocorrem em escala nanométrica em tempo real e atuará como uma imagem super-resolutiva de próxima geração em diversas aplicações, tais como biologia, ciências médicas, ciência dos materiais e nanotecnologia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a fabricação e aplicações de imagem de uma hiperlente esférica, uma técnica inovadora de imagem com super-resolução. A hiperlente oferece vantagens na imagem em tempo real e pode ser facilmente integrada com óptica convencional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imagem de super-resolução
- Engenharia óptica
- Técnicas de microscopia
Contexto
- A hiperlente é uma lente esférica com uma estrutura multicamada.
- Ela permite a ampliação de informações de alta frequência.
- As capacidades de imageamento em tempo real são uma vantagem significativa.
- Ela pode resolver informações ópticas no campo distante.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o processo de fabricação do dispositivo hiperlente.
- Mostrar sua aplicação em imageamento subdifrativo.
- Responder perguntas fundamentais em imageamento de super-resolução.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um dispositivo hipelente bidimensional.
- Integração com sistemas convencionais de microscopia.
- Obtenção de imagens em tempo real de células vivas e nanopartículas dinâmicas.
- Utilização da dispersão hiperbólica para ampliação.
Resultados Principais
- A hiperlente esférica amplia efetivamente informações bidimensionais.
- Opera em frequências visíveis.
- Capacidade comprovada de imageamento abaixo do limite de difração.
- Integração bem-sucedida com sistemas ópticos existentes.
Conclusões
- A hiperlente esférica é uma ferramenta promissora para imageamento de super-resolução.
- Ela simplifica o processo de imageamento com óptica convencional.
- Aplicações potenciais em imageamento biológico e nanotecnologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de super-resolução supera a barreira do limite de difração na microscopia convencional, permitindo a visualização de estruturas subcelulares e processos dinâmicos com resolução em escala nanométrica. A técnica de hiperlente esférica fornece imagens em tempo real no campo distante com integração simples em sistemas ópticos existentes, reduzindo a complexidade técnica em fluxos de trabalho de descoberta. Essa capacidade auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas, permitindo a observação direta de interações moleculares e do comportamento de nanopartículas em ambientes de células vivas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao resolver características subcelulares abaixo do limite de difração.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da visualização direta da dinâmica molecular em células vivas.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança em estudos de engajamento de alvos ao fornecer imagens em tempo real e sem marcação do tráfego de nanopartículas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de alto conteúdo ao permitir imagens quantitativas em nanoescala.
- Reprodutibilidade: Fornece leituras padronizadas e em tempo real em diferentes condições experimentais por meio de ampliação consistente em campo distante.
- Integração de Plataforma: Facilita a avaliação escalável de compostos pela compatibilidade com microscopia convencional e objetivas com imersão em óleo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Permite a obtenção de imagens de células vivas e nanopartículas dinâmicas, apoiando a descoberta translacional de biomarcadores em nanomedicina.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao resolver mecanismos subcelulares em modelos relevantes para a doença.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta as escolhas de avanço ao visualizar a distribuição de nanopartículas e os mecanismos de captação celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método do hiperlente insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e estudos pré-clínicos, permitindo a obtenção de imagens em escala nanométrica em cada estágio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver estruturas subcelulares e complexos moleculares.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios em triagem de compostos por meio de imageamento em tempo real com resolução abaixo do limite de difração.
- Análises: Gera medidas espaciais e temporais da dinâmica de nanopartículas e interações moleculares para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a trabalhos pré-clínicos por meio de imageamento relevante para doenças em células vivas e comportamento de nanopartículas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imageamento reutilizável em diversos projetos devido à integração simples com microscópios padrão.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir a observação direta de processos biológicos em escala nanométrica.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos consistentes de fabricação e imageamento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados mediante validação precoce em escala nanométrica.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao visualizar o engajamento do alvo e a eficácia de nanopartículas em condições semelhantes às in vivo.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em deposição de filmes finos, evaporação por feixe de elétrons e usinagem por feixe de íons focado.
- Requer acesso a sistemas de deposição em alto vácuo, instrumentação de FIB e microscopia óptica com objetivas de imersão em óleo.
- Exige padronização entre equipes para parâmetros de fabricação e condições de imagem para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de amostras biológicas e nanopartículas devido às dependências do substrato e do comprimento de onda.
- Limitado pela necessidade de controle preciso da espessura de multicamadas e operação específica para comprimentos de onda (por exemplo, 410 nm), conforme demonstrado no protocolo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Substrate Preparation
8:51
Conclusion
7:11
Results: Fabrication Results and Capability of Super-resolution Imaging of the Hyperlens
2:18
Etching the Mask Pattern, Wet-etching Process, and Removal of the Mask Layer
4:29
Multilayer Deposition, Nano-sized Object Inscription, and Imaging
