Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à tectônica de proteínas de desordem intrínseca, como alterações conformacionais devido à ligação de metal ferro. A principal vantagem dessa técnica é que ela requer muito pouco equipamento e os resultados podem ser obtidos muito rapidamente. Demonstrando o procedimento estará Matthias Stein, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para começar, use um cortador de vidro em uma placa de vidro para cortar um capilar de sílica fundida nua com um revestimento externo de poliamida e um diâmetro interno de 50 mícrons em comprimentos de 33 e 30 centímetros. Use uma caneta para marcar o meio de uma janela de detecção de um centímetro de largura a uma distância de 24,5 centímetros de uma extremidade do capilar para o experimento CGE e a 21,5 centímetros de uma extremidade do capilar para o experimento ACE. Usando um maçarico, queime o revestimento externo de poliamida 0,5 centímetros antes e depois de cada marca.

Da mesma forma, use o maçarico para remover um centímetro do revestimento em ambas as extremidades dos capilares. Em seguida, use etanol e um tecido mole para limpar as extremidades dos capilares e as janelas de detecção. Instale um capilar no sistema CE com a janela de detecção próxima à saída.

Depois de preparar as soluções, de acordo com o protocolo de texto, use solução de cloreto de cálcio 250 micromolar para encher uma seringa de 10 mililitros. Em seguida, conecte um filtro de PVDF de 0,2 mícron à seringa e empurre 2 mililitros da solução através do filtro para descartá-la. Utilize o cloreto de cálcio restante na seringa para encher 10 frascos para injetáveis até ao volume máximo permitido.

Rotule cada frasco para injetáveis como um frasco de entrada de solução de cloreto de cálcio de 250 micromolares. Em seguida, usando a solução de cloreto de cálcio, encha 10 frascos até a metade. Marque cada um como frasco de saída de solução de cloreto de cálcio de 250 micromolares.

Em seguida, com outras soluções contendo sal metálico, encha os frascos de maneira semelhante. Além disso, para cada par de frascos de entrada e saída, use 30 micromolares Tris Buffer para preparar um conjunto semelhante de frascos de entrada e saída. Com o marcador EOF de acetanilida 60 micromolares, encha 10 frascos para injetáveis.

Em seguida, use a solução de amostra de um miligrama por mililitro para encher um frasco. Após preparar a análise, de acordo com o protocolo de texto, execute a separação injetando hidrodinamicamente a solução da amostra para os experimentos de CGE e aplicando 0,1 bar por quatro minutos na entrada. Em seguida, aplique 16,5 quilovolts negativos e uma pressão de 2,0 bar em ambas as extremidades do capilar por 25 minutos.

Depois de preparar o método para as medições sem ligantes, prepare o método para as medições com ligantes usando primeiro a solução de EDTA 0,1 molar para enxaguar o capilar a 2,5 bar por 1 minuto. Em seguida, use água deionizada para enxaguar o capilar. Em seguida, equilibre o capilar usando solução de ligante para enxaguá-lo a 2,5 bar por 1,5 minutos.

Em seguida, injete a solução de acetanilida a 0,05 bar por 6 segundos e troque os frascos de entrada e saída para o ligante contendo frascos tampão. Aplique 0,05 bar por 2,4 segundos para empurrar a solução de acetanilida mais para dentro da ponta do capilar. Aplique 10,0 quilovolts por 6 minutos e detecte o pico de acetanilida do ativo em um comprimento de onda de 200 nanômetros.

Depois de enxaguar o capilar com água deionizada EDTA e a solução ligante, como antes, injete a proteína sample e troque os frascos de entrada e saída por frascos tampão contendo ligante fresco. Como alternativa, repita as medições com e sem ligantes. Em seguida, repita o método usando as soluções de ligantes alcalino-terrosos.

Por fim, use as seguintes soluções para realizar o mesmo método. Em seguida, calcule a mudança nas proporções de tamanho de carga para as várias interações de íons de proteínas metálicas. Aqui é mostrado o eletroferograma para a amostra AtHIRD11 obtida durante os experimentos CGE.

O tamanho do peptídeo aumenta da esquerda para a direita. O pico número quatro tem a maior massa e indica a proteína intacta. Os picos menores, dois e três, representam impurezas menores.

Esta figura representa o eletroferograma para acetanilida durante os experimentos da ECA. A solução de acetanilida apresenta apenas um pico alto, pois não deve conter impurezas. O tempo de detecção para o pico máximo indica o tempo de migração do fluxo eletroosmótico e é usado para o cálculo da interação.

Este eletroferograma da amostra AtHIRD11 durante o experimento ACE foi realizado na ausência de SDS e íons metálicos. Além das duas impurezas do eletroferograma CGE, pelo menos cinco picos, que estão relacionados à própria proteína, estão presentes. Uma avaliação gráfica das mudanças de tempo de migração medidas na presença dos vários íons metálicos para o pico seis é mostrada aqui.

É representado pelo valor calculado Delta R sobre RF. Cada resultado indica a força de uma mudança ocorrida por seu valor e seu sinal, conforme indicado pela mudança geral na carga dos complexos de íons metálicos de proteínas. Uma vez dominada, a técnica pode ser feita para um parceiro de interação em oito horas, incluindo a interação CGE, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trocar as soluções de proteína para medições de longo prazo, pois os produtos de degradação podem aumentar com o tempo e trocar as soluções Tris Buffer para obter resultados mais precisos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cortar e limpar um capilar, bem como configurar um método de eletroforese capilar de afinidade, a fim de avaliar o comportamento de ligação de proteínas desordenadas intrínsecas.