Prever amputação usando células progenitoras mononucleares circulantes locais em pacientes tratados com angioplastia com isquemia de membros críticos

Embora a angioplastia melhore o fluxo sanguíneo na isquemia crítica do membro, alguns pacientes ainda evoluirão para amputação do membro. Em comparação com o prognóstico baseado em fatores de risco tradicionais e características vasculares intrínsecas, o número de CPMs locais pode ser mais preditivo do desfecho clínico, em relação à disfunção endotelial e amputação do membro. O número de CPMs locais representa um indicador promissor do prognóstico de eventos vasculares, como isquemia, cardiopatia e isquemia de membros inferiores, com potencial aplicação na estratificação de risco e aplicação da prevenção.

Demonstrando os procedimentos estarão Eduardo Vera-Gomez, Alejandro Hernandez-Patricio, Carolina Aranda-Rodriguez, Juan Ariel Gutierrez-Buendia, Atzin Sua Ruiz-Hernandez, Mario Antonio Tellez-Gonzalez e Gabrielle Alexandra Dominguez-Perez. Os doutorados dos laboratórios de metabolismo experimental e regeneração tecidual também serão Gabrielle Hernandez-De Rubin e Oscar Antonio Loman-Zuniga. E estes do departamento de cirurgia vascular.

Para determinar a DFM pré e pós-angioplastia, use um transdutor linear vascular para medir o diâmetro da artéria braquial do paciente. Em seguida, coloque o manguito de um esfigmomanômetro acima do local de medição no antebraço e insufle o manguito 50 milímetros de mercúrio acima da pressão arterial sistólica por cinco minutos antes de desinflar. Dentro de 60 segundos após a desinsuflação, meça novamente o diâmetro da artéria braquial e use a equação para estimar a FMD.

Para avaliar a gravidade clínica da isquemia do membro, de acordo com a classificação de Rutherford, coloque uma agulha de calibre 18 no vaso sanguíneo no local da virilha selecionado e coloque um introdutor sobre a agulha. Avance um fio-guia flexível no introdutor e substitua o guia por um introdutor de seis franceses. Usando orientação fluoroscópica, injete meio de contraste para identificar a trajetória da artéria e os locais vasculares bloqueados.

Introduza dois fios-guia de navegação franceses 0,014 e dois, fios-guia de suporte franceses 0,014 na embarcação e avance os fios-guia para o local bloqueado. Em seguida, introduza um cateter de cinco French e, em seguida, um cateter de três French e colete 10 mililitros de sangue do local mais próximo da obstrução vascular. Coloque a amostra no gelo e avance um fio-guia novamente.

Quando o fio-guia estiver no lugar, introduza um cateter-balão de angioplastia, contendo um balão inflável localizado na extremidade do cateter, e avance o cateter-balão de angioplastia até o local da lesão. Encha o balão contra a placa de bloqueio, localizada na parede vascular, e verifique a restauração do fluxo sanguíneo. 30 minutos após a realização da angioplastia, avance um cateter para o local mais próximo do bloqueio vascular e colete 10 mililitros de sangue.

Em seguida, remova todos os fios-guia e forneça os cuidados pós-operatórios adequados. Duas semanas após a angioplastia, avaliar a gravidade clínica da isquemia do membro, a resolução da dor em repouso, a isquemia inferior e a preservação funcional do pé, de acordo com a classificação de Rutherford, e identificar os casos que necessitam de amputação maior devido a um desfecho desfavorável. Dentro de uma hora após a coleta, transfira seis mililitros de cada amostra de sangue coletada para novos tubos de 15 mililitros e dilua as amostras na proporção de um para um em PBS.

Adicione dois mililitros de meio gradiente de densidade a cada um dos três tubos de ensaio e adicione três alíquotas de volume igual do sangue diluído a cada tubo até não mais do que três quartos cheios. Separe as células sanguíneas por centrifugação com gradiente de densidade e use uma pipeta para coletar as células da interface das camadas resultantes. Puxe as células de cada amostra em um único tubo de 15 mililitros e lave cada amostra seis vezes, com dois mililitros de PBS por lavagem.

Após a última lavagem, ressuspenda o MPC contendo pellets em um mililitro de PBS por amostra para contagem e adicione uma vez 10 às seis células por tubo ao número apropriado de tubos de citometria de fluxo de cinco mililitros por amostra. Pulverize as células por centrifugação e ressuspenda cada amostra de célula em 100 microlitros do coquetel de anticorpos de interesse por 10 segundos, antes de incubar as células por 20 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz. No final da incubação, use anticorpos de controle pareados com o isotipo para configurar as comportas de dispersão frontal e lateral apropriadas para análise e use um tubo contendo um grande número de células CD45 e CD34 positivas para bloquear os NPCs.

Para selecionar fenótipos imunológicos duplos positivos, crie novos gráficos e identifique as células KDR, CD133 e CD184 positivas, CD34 positivas, CD45 positivas e, em seguida, identifique as principais subpopulações de MPC. O número de CPM pode então ser correlacionado com o valor basal da DFM e o delta da DFM pós-angioplastia e a proporção de pacientes que necessitam de amputação importante do membro inferior. Nesta análise representativa, 30 dias após a angioplastia de membros inferiores, o número basal de MPCs CD45 positivos, CD34 positivos, KDR positivos, correlacionou-se negativamente com a FMD.

Considerando que a mudança nos MPCs CD45 positivos, CD34 positivos, CD133 positivos, CD184 positivos, após a angioplastia, correlacionou-se significativamente com a melhora da FMD. Um aumento do número basal de subpopulações MPCs CD45 positivas, CD34 positivas, KDR positivas, bem como redução pós-angioplastia nas células MPC CD45 positivas, CD34 positivas, CD133 positivas, CD184 positivas, também foram observadas em pacientes que evoluíram para amputação de membro, Durante a abordagem vascular, certifique-se de coletar o sangue do local mais próximo da obstrução vascular.