Name: Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter baseados em luminescência. Este método robusto e quantitativo facilita a descoberta de medicamentos em oncologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Todo o trabalho foi financiado pela Artios Pharma Ltd. A Figura 1 e a Figura 3 foram criadas com Biorender.com.

Quantificando o reparo da ruptura da fita dobro do ADN com ensaios do repórter de Nanoluciferase

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S e H.M.R.R. são todos funcionários e acionistas da Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. é acionista da AstraZeneca PLC. S.J.B. é cientista fundador e acionista da Artios Pharma Ltd. Foi registrada uma patente em alguns dos repórteres descritos neste estudo (WO 2021/001647). Promega é a fonte da tecnologia NanoLuc® e dos polinucleotídeos NanoLuc® modificados. A Artios Pharma foi autorizada pela Promega a gerar os polinucleotídeos NanoLuc® modificados.

Aqui, descrevemos protocolos para a geração e implementação de um conjunto de repórteres baseados em luminescência extracromossômica para medir a proficiência celular das quatro principais vias DSBR (HR, NHEJ, MMEJ e SSA)7. Os substratos repórter podem ser introduzidos nas células por transfecção transitória e usados para avaliar a atividade do DSBR usando uma leitura sensível e robusta baseada em placas da luminescência do NanoLuc, que é reconstituída após o envolvimento com as vias DSBR celulares cognatas.
Vários estágios de geração de substrato repórter, transfecção dos substratos em células e interpretação de dados são essenciais para a execução bem-sucedida desses ensaios. Embora técnicas padrão de biologia molecular sejam usadas para gerar os substratos repórteres, a visualização do processo por eletroforese em gel garante a mais alta qualidade e pureza dos substratos antes da transfecção. Como esses ensaios dependem de transfecção transitória, aplicam-se considerações comuns para esses métodos. Isso inclui a otimização da densidade de semeadura, condições de transfecção (incluindo reagentes e quantidades de DNA) e avaliação da adequação em formatos de transfecção direta e reversa. Esses ensaios repórter foram realizados com sucesso com uma variedade de protocolos de eletroporação e lipofecção, e as opções devem ser totalmente exploradas antes de realizar esses ensaios. Deve-se também tomar cuidado para inspecionar os sinais componentes NanoLuc e Firefly, em vez de apenas o sinal de reparo composto derivado da normalização do sinal NanoLuc (substrato repórter) para o sinal Firefly (controle). Artefatos podem surgir da proporção sendo impulsionada por mudanças no sinal Firefly. Por exemplo, avaliar a inibição no modo dose-resposta usando um composto altamente específico deve suprimir o sinal NanoLuc de maneira titulável sem perturbar o sinal Firefly, que deve permanecer estável ( Figura 4G, H ). No entanto, nos casos em que os sinais do Firefly são perturbados, impactos úteis no reparo ainda podem ser determinados pela identificação de uma janela de dose em que o sinal do Firefly não é afetado (Figura 5).
Em comparação com os ensaios repórter DSBR usados com mais frequência, esses ensaios repórter baseados em luminescência extracromossômica têm algumas vantagens distintas. Como as vias DSBR são altamente conservadas, mesmo que a maquinaria celular varie entre os modelos celulares, os ensaios ainda podem relatar a proficiência em DSBR e a escolha da via. Isso abre a avaliação do DSBR para qualquer modelo de interesse do usuário, desde que as condições ideais de transfecção transitória sejam estabelecidas com antecedência.
O uso da Nanoluciferase como gene repórter também oferece vantagens sobre as opções fluorescentes, que têm sido usadas tradicionalmente em ensaios repórter DSBR. O NanoLuc é de maturação rápida e a luminescência é detectada com alta sensibilidade usando um leitor de placas8. Juntamente com a velocidade de reparo do substrato (à medida que os substratos repórter são transfectados em células com extremidades DSB prontas para reparo), este formato de ensaio repórter DSBR é ideal para o retorno rápido e a robustez quantitativa necessária para a triagem de pequenas moléculas como parte de uma cascata de descoberta de medicamentos industriais. De fato, descrevemos recentemente a implementação do ensaio repórter MMEJ independente de ressecção na cascata de descoberta usada para a identificação de inibidores de pequenas moléculas do domínio13 da polimerase Polθ.
Há também flexibilidade na implementação dos ensaios repórter para abordar questões específicas sobre perturbações genéticas e farmacológicas do DSBR (Figura 3). Por exemplo, antes da transfecção dos substratos repórteres, as células podem ser transfectadas com siRNA contra um gene de interesse por 48-72 h. Alternativamente, os efeitos da superexpressão gênica nas vias DSBR podem ser testados realizando a transfecção de plasmídeo 24-48 h antes da transfecção de substratos repórter. Para estudos farmacológicos, o presente protocolo já descreve como o uso de pequenas moléculas pode ser incorporado ao fluxo de trabalho padrão, mas formatos alternativos podem incluir alterações nos regimes de tratamento de compostos, como pré-incubações ou washouts.
A escalabilidade da transfecção transitória também pode suportar abordagens de triagem em larga escala nas quais a transfecção em lote de substratos repórter é realizada antes da triagem. Além disso, a duração do ensaio desde a transfecção até a leitura também pode ser variada. Embora as durações padrão possam ser de 16 a 24 horas, alguns ensaios podem ser lidos em apenas 6 horaspor semana. Preocupações com a toxicidade de pequenas moléculas ou siRNA que podem comprometer a viabilidade celular também devem ser consideradas na determinação da duração do ensaio.
Em resumo, os ensaios descritos neste estudo e totalmente descritos em uma publicação recente7 fornecem uma avaliação rápida e robusta da proficiência celular em DSBR. Eles são altamente sensíveis e tituláveis, tornando-os passíveis de estudos genéticos e farmacológicos. Crucialmente, como os substratos repórteres podem ser introduzidos nas células por transfecção transitória, eles têm o potencial de serem utilizados em qualquer modelo de célula transfectável de interesse, em vez de serem restritos a linhagens celulares específicas por integração estável, como é o caso dos repórteres DSBR cromossômicos. No entanto, uma limitação distinta desses ensaios extracromossômicos repórter é que a falta de integração no genoma pode não recapitular totalmente o contexto fisiológico e cromatinizado do reparo do DNA e suas pistas regulatórias e orquestração associadas15. Para esse fim, os ensaios repórter extracromossômicos são complementares aos métodos existentes de avaliação DSBR e expandem o kit de ferramentas de recursos adequados para pesquisa básica e descoberta de medicamentos.

As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) representam uma classe particularmente tóxica de dano ao DNA1 devido à qual as células desenvolveram múltiplas vias de reparo de DSB (DSBR) para reparar essas lesões. Os quatro principais mecanismos de DSBR são recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga (NHEJ), junção de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ) e recozimento de fita simples (SSA) 2 , 3 . As vias DSBR contribuem para a manutenção do desenvolvimento e fisiologia de tecidos saudáveis e protegem contra doenças como o câncer. Além disso, esses mecanismos de reparo possuem potencial terapêutico para o desenvolvimento de moduladores de pequenas moléculas em oncologia de precisão. Por exemplo, o direcionamento da DNA polimerase θ (Polθ), uma enzima fundamental na via de reparo do MMEJ, atraiu interesse devido à sua letalidade sintética com deficiência de HR no câncer4.
A compreensão do DSBR, portanto, tem amplas implicações clínicas e são necessários ensaios celulares funcionais capazes de medir a atividade de todas as principais vias do DSBR5. Os ensaios devem ser adequados para interrogação genética e farmacológica e implantáveis em modelos celulares de interesse. Para apoiar os esforços de descoberta de medicamentos de moléculas pequenas, os ensaios devem ser altamente sensíveis, tituláveis, ter um retorno rápido e ser escaláveis para formatos de alto rendimento adequados para triagem de compostos.
Em geral, o DSBR foi medido anteriormente usando sistemas de ensaio repórter baseados em fluorescência integrados de forma estável ao genoma celular6. No entanto, embora a recapitulação fisiológica do DSBR cromossômico seja uma vantagem distinta, esses ensaios são restritos a um modelo hospedeiro no qual o repórter está integrado, utilizam preparação e análise de amostras trabalhosas por citometria de fluxo e têm rendimento limitado, tempo de resposta, robustez e sensibilidade, todos recursos essenciais necessários para os esforços de descoberta de medicamentos.
Aqui, descrevemos um conjunto de ensaios de repórter DSBR que permitem a avaliação das quatro principais vias DSBR. O conjunto de substratos de ensaio repórter é descrito na Figura 1 e descrito em uma publicação recente7. Eles são extracromossômicos, permitindo sua introdução nas células por simples transfecção transitória, e a incorporação de um gene repórter de nanoluciferase8, que deve ser reconstituído pelo envolvimento com mecanismos específicos de DSBR, gera sensibilidade, robustez e escalabilidade. As seguintes variantes de substrato do repórter DSBR estão incluídas no protocolo (Figura 1):
MMEJ independente de ressecção: Este substrato linear é composto por uma região central de DNA de fita dupla (dsDNA) com saliências de DNA de fita simples (ssDNA), que imitam as extremidades ressecadasdo DNA 9. Quatro microhomologias de nucleotídeos nos terminais das regiões do ssDNA codificam o códon inicial para o gene repórter. O reparo desse substrato por meio do MMEJ restaura o quadro de leitura aberto (ORF) do gene repórter.
MMEJ dependente de ressecção: O éxon do gene repórter N-terminal é interrompido por um segmento contendo um códon de parada, que é flanqueado por 8 microhomologias de pares de bases (bp). A ressecção nucleolítica da extremidade é necessária antes do reparo mediado por MMEJ para restaurar o gene repórter intacto.
NHEJ contundente: O gene repórter é dividido em seções N- e C-terminais, das quais a última é colocada a montante do promotor. O DSB é produzido usando EcoRV e requer ligação direta (sem processamento final) por NHEJ para que ambas as porções do gene repórter sejam reunidas novamente e o ORF repórter seja restaurado.
NHEJ não contundente: O DSB está localizado dentro de um íntron e terá extremidades coesivas ou não coesivas, dependendo da escolha da enzima de restrição. O reparo deste substrato por NHEJ requer que a ligadura seja precedida pelo processamento final.
HR de modelo longo: O éxon N-terminal do gene repórter é interrompido por um segmento de DNA contendo locais de restrição, que substituem 22 pb da sequência original do gene repórter. Para restaurar essa sequência, o reparo por HR usa o modelo de homologia de 2,5 kilobase (kb) colocado a jusante do éxon C-terminal.
Modelo curto de RH: O local de restrição necessário para gerar o DSB substitui parte da sequência do gene repórter nativo e introduz um códon de parada no quadro. Como a versão de modelo longo, este substrato HR requer o modelo de homologia downstream (360 bp) para reparo e restauração precisos do ORF repórter.
SSA: Este substrato contém um códon de parada prematuro localizado dentro do éxon N-terminal do gene repórter. A remoção deste códon de parada e a reintegração da sequência intacta do gene repórter requerem reparo por SSA, que envolve ressecção bidirecional de longo alcance antes do alinhamento das homologias.
Para a geração do DSB, alguns dos substratos repórter podem ser digeridos com I-SceI (Figura 1). Isso gerará um substrato linear com extremidades não coesivas nos repórteres MMEJ dependentes de ressecção, NHEJ não romba, HR de modelo longo e SSA, que possuem locais I-SceI em tandem em orientações invertidas. No substrato de repórter de RH de modelo curto, a digestão do único site I-SceI gerará extremidades coesas. Os plasmídeos NHEJ não contundentes, MMEJ dependente de ressecção, HR de modelo longo e SSA também podem ser digeridos com HindIII, que produzirá extremidades coesivas complementares.
Fornecemos protocolos para a geração dos substratos do ensaio repórter e descrevemos como os ensaios podem ser realizados, fornecendo detalhes sobre como eles podem ser usados para quantificar o DSBR, incluindo respostas tituláveis a pequenas moléculas, avaliação da potência celular, atividade no alvo e seletividade da via.

<table><tbody><tr><td>10x tampão TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-acrilamida gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x tampão TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Gel Loading Dye, Roxo</td><td>NEB</td><td>B7024S</td> Placa branca de 96 poços <td></td></tr><tr><td>(com fundo e tampa transparentes)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Para purificação baseada em contas de</td></tr><tr><td>DNA Fosfatase Antártica e tampão 10X</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101 Leitor de</td><td>Placas</td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td> Contador de Células <td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Contador de Células</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos personalizados</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Pedido personalizado</td><td>Para substrato MMEJ independente de ressecção. Veja a Tabela 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>Dispensador de compostos à base de DMSO</td></tr><tr><td>D300e D4+</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>de alto volume para dispensador de compostos D300e</td></tr><tr><td>T8+</td><td></td><td>Tecan 30097370</td><td>de baixo volume para dispensador de compostos D300e</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, grau de cultura de células</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Veículo para compostos, usado na Figura 4 e Figura 5</td></tr><tr><td>Plasmídeos de fonte repórter DSBR</td><td>Artios</td><td></td><td>Disponível para a comunidade acadêmica mediante solicitação&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF e 10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Escada de DNA de baixo peso molecular</td></tr><tr><td>Células HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Exemplo de linha celular usada no protocolo</td></tr><tr><td>HindIII-HF e 10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Biologia Molecular grau água</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI e 10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME reagente e tampão</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Reagente de transfecção à base de lípidos</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Centrífuga para tubos de 15 ou 50 mL</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Meio de cultura para células HEK-293</td></tr><tr><td>Microplaca agitador</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Agitador orbital de microplacas</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Centrífuga para tubos de 1,5 ou 2 mL</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Dispensador de reagentes à base de células ou água</td></tr><tr><td>padrão MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>para dispensador de reagentes MultiDrop</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & Glo Buffer e Substrato</td><td>Promega</td><td>N1630 ou N1650</td><td>Reporter luciferase (NanoLuc) reagente para extinguir a luminescência do vaga-lume e detectar a luminescência do NanoLuc. Parte do kit do Sistema de Ensaio Reporter Nano-Glo Dual-Luciferase</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 ou N1650</td><td>Controle o reagente de ensaio de luciferase (Firefly) para detectar Firefly. Parte do kit do sistema de ensaio Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter</td></tr><tr><td>PBS (sem cálcio ou magnésio)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Plasmídeo Firefly (ou similar)</td><td>Promega</td><td>E1310 (ou equivalente)</td><td>Plasmídeo de controle Firefly</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc plasmídeo (ou similar)</td><td>Promega</td><td>N1091 (ou equivalente)</td><td>NanoLuc</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA roxa de carga rápida de 1 kb</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Escada de DNA de alto peso molecular</td></tr><tr><td>Acetato de sódio (3 M), pH 5,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Para ajuste de pH durante a extração de gel com o kit de extração de gel QIAquick</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Para visualização de ssDNA e dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Para visualização de dsDNA apenas</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase e tampão 10x Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue mancha 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Para medição da viabilidade durante a contagem de células</td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA; 0,25% de tripsina e 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI e 10x buffer CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de dna usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

O reparo de quebras de fita dupla de DNA (DSBs) é crucial para a manutenção da estabilidade do genoma e da viabilidade celular. O reparo de DSB (DSBR) em células é mediado por vários mecanismos: recombinação homóloga (HR), junção de extremidade não homóloga (NHEJ), junção de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ) e recozimento de fita simples (SSA). Os ensaios celulares são essenciais para medir a proficiência e modulação dessas vias em resposta a vários estímulos.
Aqui, apresentamos um conjunto de ensaios repórteres extracromossômicos que medem a reconstituição de um gene repórter de nanoluciferase por uma das quatro principais vias DSBR nas células. Após a transfecção transitória em células de interesse, o reparo de substratos repórter específicos da via pode ser medido em menos de 24 h pela detecção de luminescência de Nanoluciferase (NanoLuc).
Esses ensaios robustos são quantitativos, sensíveis, tituláveis e passíveis de um formato de triagem de alto rendimento. Essas propriedades fornecem amplas aplicações na pesquisa de reparo de DNA e descoberta de medicamentos, complementando o kit de ferramentas atualmente disponível de ensaios DSBR celulares.

O reparo de cada um dos ensaios repórter pode ser detectado e quantificado usando o mesmo procedimento. O reparo correto de um substrato por sua via de reparo cognato nas células reconstituirá um ORF funcional intacto que codifica NanoLuc. Este sinal de luminescência pode ser detectado usando um leitor de placas.
A co-transfecção com um plasmídeo intacto que codifica a luciferase Firefly serve como um controle de transfecção. Esse controle serve a dois propósitos. Primeiro, ele fornece um padrão para normalizar o sinal NanoLuc, pois não deve ser perturbado pela modulação do DSBR por meios genéticos ou farmacológicos. Em segundo lugar, pode fornecer uma indicação de perturbações celulares fora do alvo que afetam o sinal da luciferase, como modulação do ciclo celular, efeitos na transcrição/tradução ou toxicidade geral.
A proporção de NanoLuc para Firefly serve como uma leitura substituta do reparo. Os valores de luminescência podem ser exportados e analisados normalizando os dois sinais de luciferase de dentro do mesmo poço. No caso de estudos de perturbação genética (por exemplo, comparando o tipo selvagem e KO ou siRNA não direcionado e alvo), o reparo geralmente é normalizado para a amostra parental (células do tipo selvagem ou células tratadas com siRNA de controle não direcionado). No caso da modulação farmacológica, os valores de uma amostra tratada com composto são normalizados para o valor produzido pelo tratamento com veículo.
A validação completa do conjunto de repórteres descrito foi publicada recentemente7. Os dados que exemplificam a caracterização da modulação genética e farmacológica da DSBR são mostrados na Figura 4 (adaptada da 7). Polθ é o principal mediador do MMEJ e prevê-se que a perda ou inibição dessa enzima ablação especificamente do MMEJ celular 3,10. Usando uma linha celular na qual o POLQ, o gene que codifica o Polθ, foi nocauteado11, o ensaio repórter MMEJ independente de ressecção demonstra que o MMEJ é de fato quase totalmente suprimido. A avaliação dos sinais de luminescência do componente NanoLuc e Firefly mostra que o defeito de reparo observado é impulsionado por uma redução no sinal NanoLuc (codificado pelo substrato repórter), enquanto o sinal Firefly (controle) não é perturbado ( Figura 4A-C ). Em contraste, a avaliação da proficiência em NHEJ usando o repórter NHEJ de extremidade romba demonstra que o nocaute POLQ não inibe o reparo do substrato repórter (Figura 4D-F). Juntos, esses dados genéticos apóiam o papel específico de Polθ no reparo mediado por MMEJ. Essas observações são totalmente recapituladas farmacologicamente com ART55812,13, um inibidor altamente potente e específico recentemente relatado do domínio polimerase de Polθ (Figura 4G), onde é observada inibição titulável de MMEJ, que deriva de uma diminuição específica no NanoLuc e não no sinal Firefly (Figura 4H). Além disso, e de acordo com os dados genéticos, não há efeito sobre o NHEJ (Figura 4I, J). Juntos, esses dados destacam como esses repórteres podem ser usados para caracterizar a modulação genética das vias DSBR e mostrar a potência celular e a especificidade do alvo / via de pequenas moléculas.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Figura 4: Efeitos do nocaute genético e da inibição farmacológica de Polθ nos sinais repórter MMEJ e NHEJ. As células eHAP1 WT e POLQ(-) foram transfectadas com um plasmídeo de controle Firefly e com (A-C) o repórter MMEJ independente de ressecção ou (D-F) repórter NHEJ de extremidade romba. A porcentagem de reparo de MMEJ ou NHEJ é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de vaga-lume, normalizada para o controle tratado com DMSO, 24 h após a transfecção. Os dados representam ± SEM médio de três réplicas biológicas, cada uma com média de 8 réplicas técnicas. As células HEK-293 foram transfectadas com um plasmídeo de controle Firefly e (G,H) o repórter MMEJ independente de ressecção ou o repórter NHEJ de extremidade romba (I,J) e tratadas com o inibidor da polimerase Polθ ART558. A porcentagem de reparo é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de vaga-lume, normalizada para o controle tratado com DMSO, 24 h após a transfecção. A porcentagem de inibição dos sinais de luminescência individuais em (G) e (I) foi calculada em relação ao controle tratado com DMSO e mostrada respectivamente em (H) e (J). Os dados representam ± média de SEM de 2 réplicas biológicas, cada uma com média de 4 réplicas técnicas. Essa figura foi adaptada de Rajendra et al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; WT = tipo selvagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Figura 5: Inibição do sinal repórter HR pelo inibidor RAD51 CAM833. (A) As células HEK-293 foram transfectadas com o substrato repórter HR de modelo longo, um plasmídeo de controle de luciferase Firefly e tratadas com o inibidor RAD51 CAM83314. A luminescência de NanoLuc e Firefly foi lida 16 h após a transfecção. A porcentagem de reparo de HR é a razão entre a luminescência de NanoLuc e a luminescência de Firefly, normalizada para o controle tratado com DMSO. As linhas tracejadas destacam a porcentagem de inibição de HR e a concentração de CAM833 na curva EC50. Os dados representam ± média de SEM de 2 réplicas biológicas, cada uma com média de 4 réplicas técnicas. (B) A porcentagem de inibição dos sinais de luminescência individuais em (A) foi calculada em relação ao controle tratado com DMSO. As linhas tracejadas destacam a porcentagem de inibição de NanoLuc e Firefly em 3,33 μM CAM833 (EC50). A diminuição do sinal Firefly em concentrações de CAM833 ≥ 10 μM é indicativa de toxicidade do composto em altas doses; no entanto, a redução do sinal de NanoLuc é observada em concentrações onde o sinal Firefly não é afetado, sugerindo que o CAM833 induz a inibição de HR no alvo. Essa figura foi adaptada de Rajendra et al.7. Abreviaturas: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = recombinação homóloga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Substrato repórter</td>
			<td>Plasmídeo de origem (tamanho em kb, resistência)</td>
			<td colspan="3">Geração de DSB</td>
			<td>Tamanho esperado do substrato do relator final (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ independente de ressecção</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Ressecado 3 'caudas através de ligadura de tampas</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ dependente de ressecção</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ sem corte</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Extremidades rombas após a excisão do plasmídeo por EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ não contuso</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HR de modelo longo</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modelo curto HR</td>
			<td>9.3, Amp</td>
			<td colspan="3">I-SceI (coeso)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (não coeso), HindIII (coeso)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Plasmídeos de substrato repórter. Abreviaturas: DSB = quebra de fita dupla; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples; Kan = canamicina; Amp = ampicilina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Sequência (5'-3')</td>
			<td>Fornecedor</td>
			<td>Purificação</td>
			<td>Função</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tampa esquerda, oligonucleotídeo longo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tampa esquerda, oligonucleotídeo curto</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tampa direita, oligonucleotídeo longo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PÁGINA</td>
			<td>Tampa direita, oligonucleotídeo curto</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Oligonucleotídeos para tampas para geração de substrato repórter MMEJ independente de ressecção. Abreviaturas: ssDNA = DNA de fita simples; dsDNA = DNA de fita dupla; MMEJ = junção de extremidade mediada por microhomologia; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida. As microhomologias são sublinhadas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ensaio do repórter</td>
			<td>DNA do substrato repórter NanoLuc (μg DNA/1x106 células)</td>
			<td>Plasmídeo de luciferase de controle de vaga-lumes (μg DNA/1x106 células)</td>
		</tr><tr><td>MMEJ independente de ressecção</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>MMEJ dependente de ressecção</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ sem corte</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ não contuso</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>HR de modelo longo</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Modelo curto HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Quantidades de DNA para transfecção transitória de substratos repórter NanoLuc e plasmídeo de luciferase de controle Firefly (HEK-293, formato de placa de 96 poços). Abreviaturas: MMEJ = junção de extremidades mediada por microhomologia; NHEJ = junção de extremidade não homóloga; HR = recombinação homóloga; SSA = recozimento de fita simples.

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.

Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Este protocolo apresenta um novo sistema genético repórter e a configuração experimental para detectar transcrição em quebras de dupla cadeia de DNA com sensibilidade de molécula única.

Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

Aprenda a avaliar a atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter baseados em luminescência. Este método robusto e quantitativo facilita a descoberta de medicamentos em oncologia.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Explorar mais vídeos