Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência
14 de junho de 2024
Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.
A Artios está desenvolvendo novos medicamentos anticâncer direcionados à resposta a danos no DNA. Para permitir isso, desenvolvemos uma série de novos ensaios para medir a atividade de reparo do DNA celular. Esses ensaios tiveram um grande impacto em nossos programas, levando a ativos em estágio clínico sendo testados em pacientes com altas necessidades médicas não atendidas.
Medir com precisão a atividade celular no alvo é essencial para o progresso de novas terapias direcionadas. A geração de ensaios para fatores de reparo de DNA com as propriedades necessárias para alimentar uma campanha eficiente de descoberta de medicamentos tem sido um desafio, seja a necessidade de alto rendimento, sinal-ruído robusto, retorno rápido e, idealmente, portabilidade para diferentes sistemas biológicos. Desenvolvemos um conjunto de ensaios repórter robustos, quantitativos e tituláveis baseados em luminescência para medir a proficiência de quatro principais vias de reparo de ruptura de fita dupla, recombinação homóloga, junção de extremidade não homóloga, junção de extremidade mediada por microhomologia e recozimento de fita simples.
Esses ensaios repórter são validados como reparo dependente da via de leitura, são sensíveis à modulação farmacológica e têm um tempo de resposta rápido. Os substratos de reparo que desenvolvemos são extracromossômicos, portanto, podem ser transfectados transitoriamente em modelos de interesse e facilmente dimensionados para um formato de alto rendimento. Acreditamos que nossos sistemas de ensaio têm um lugar importante para permitir a descoberta de medicamentos DDR, mas também para aprofundar nossa compreensão da biologia DDR de forma mais ampla.
A este respeito, esperamos que os métodos ajudem a acelerar a identificação e o processamento de novos alvos de drogas, levando a medicamentos para doenças como o câncer, onde há alta necessidade médica não atendida.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para avaliar a competência da via de reparo de quebra de dupla cadeia em células usando substratos reportadores extracromossômicos baseados em luminescência. Os ensaios desenvolvidos são cruciais para compreender a resposta ao dano do DNA e facilitar a descoberta de medicamentos em oncologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Resposta ao dano do DNA
- Mecanismos de reparo celular
- Descoberta de medicamentos em oncologia
Fundo
- Quebras de dupla cadeia no DNA são lesões críticas que necessitam de reparo eficiente.
- Compreender as vias de reparo é essencial para desenvolver terapias cancerígenas direcionadas.
- Ensaios existentes para medir a atividade de reparo do DNA têm limitações em rendimento e sensibilidade.
- Ensaios novos podem melhorar os esforços de descoberta de medicamentos medindo com precisão a atividade celular.
Propósito do Estudo
- Desenvolver ensaios robustos para medir a competência nas principais vias de reparo de quebra de dupla cadeia.
- Facilitar a identificação de novos alvos de medicamentos no tratamento do câncer.
- Melhorar a compreensão da biologia da resposta ao dano do DNA.
Métodos Usados
- Desenvolvimento de ensaios reportadores baseados em luminescência para quatro vias de reparo.
- Transfecção transitória de substratos extracromossômicos em modelos celulares.
- Medição de sinais de luminescência para avaliar a competência do reparo.
- Validação dos ensaios para sensibilidade à modulação farmacológica.
Principais Resultados
- Os ensaios demonstraram atividade de reparo dependente da via.
- Medições quantitativas mostraram sensibilidade à modulação por medicamentos.
- Foram alcançados tempos de resposta rápidos para os resultados dos ensaios.
- Os ensaios são escaláveis para triagem de alto rendimento.
Conclusões
- Os ensaios desenvolvidos são ferramentas valiosas para a descoberta de medicamentos em câncer.
- Eles melhoram a compreensão dos mecanismos de reparo do DNA.
- Esses métodos podem acelerar a identificação de novos alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative luminescence-based reporter assays for DNA double strand break repair enable high-throughput, pathway-specific measurement of cellular DNA repair activity, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. These assays provide rapid, reproducible, and scalable outputs essential for advancing DNA damage response (DDR) therapeutics. Their integration into discovery pipelines enhances predictive confidence and portfolio triage for DDR-targeted assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DDR pathway activity for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing pathway-specific repair proficiency.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and biological relevance.
- Accelerates identification and prioritization of novel DDR drug targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts for robust assay standardization.
- Delivers high-throughput, scalable formats suitable for compound screening.
- Ensures reproducibility and titratability across diverse biological systems.
- Enables reliable evaluation of pharmacological modulation of DNA repair pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway-specific repair measurements with disease-relevant DDR biology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of DDR targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for DDR-focused portfolios.
- Provides mechanistic insights to guide translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation of DDR-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for DDR mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides sensitive luminescence measurements to compare repair activity across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of cellular repair proficiency with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable platform adaptable to multiple cell systems and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates assay workflows with high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biological readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DDR-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and luminescence assay design.
- Needs access to luminescence plate readers and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various cell models via transient transfection of extrachromosomal substrates.
- Dependent on validated controls to distinguish pathway-specific repair activity.
