ДНК-идентификация видов рыб протокола

Система идентификации видов рыб — это простой, быстрый и точный метод идентификации видов рыб, присутствующих в данном образце, основанный на ДНК. Образцы рыб обрабатывают протеиназой К для высвобождения нуклеиновых кислот в раствор. Затем ДНК генома рыбы выделяют и амплифицируют ПЦР с использованием праймеров, которые связываются с последовательностями, обнаруженными во всех геномах рыб.

Затем продукты ПЦР расщепляются с помощью трех различных ферментов рестрикции и растворяются на биоанализаторе Agilent 2100. Длины фрагментов, образующихся в реакциях пищеварения, могут быть использованы для определения вида рыб с помощью полиморфизма длины рестрикционных фрагментов или программного обеспечения для сопоставления шаблонов RFLP. Здравствуйте, я Рэйчел Формоза из Agilent Technologies.

Сегодня мы покажем вам процедуру идентификации видов рыб по ДНК. Эта процедура представляет собой метод скрининга, который позволяет идентифицировать виды рыб, присутствующие либо в свежих, замороженных, измельченных, приготовленных, сушеных или иным образом обработанных образцах. И это можно сделать менее чем за один рабочий день.

Мы используем эту процедуру для изучения подлинности морепродуктов, что очень важно для индустрии морепродуктов, поскольку подмена и неправильная маркировка могут иметь значительные экономические, экологические последствия и последствия для безопасности пищевых продуктов. Кроме того, может быть особенно сложно определить виды рыб с помощью визуальной идентификации и других традиционных методов. После того, как рыба была обработана, тестирование ДНК дает гораздо более точный и надежный результат.

Итак, приступим. Начните подготовку образцов для экстракции ДНК с помещения от 10 до 1000 миллиграммов каждого образца ткани сырой или приготовленной рыбы в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров для каждой рыбы. Наберите 220 микролитров свежеприготовленного раствора протеиназы и пипеткой вверх и вниз.

Инкубируйте пробирки при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут после инкубационной центрифуги в течение трех-пяти минут при 14 000 G, чтобы измельчить любые непереваренные ткани. Затем осторожно перелейте по 150 микролитров каждой надосадочной жидкости в свежую 1,5-миллилитровую трубку, избегая непереваренного материала внизу и маслянистого материала, присутствующего наверху. Теперь надосадочная жидкость будет использоваться для экстракции геномной ДНК.

Начните экстракцию геномной ДНК с добавления 500 микролитров буфера, связывающего нуклеиновую кислоту, в каждый образец. Это позволит довести общий объем образца до 650 микролитров. Сделайте образец вихревым путем до гомогенизации.

Затем перенесите каждый образец в чашку для связывания ДНК, которая была помещена в одну из двух пробирок для миллилитровых сосудов, входящих в комплект. Защелкните крышку трубки на верхней части чашки. Вращайте образцы в течение одной минуты при давлении 14 000 G, чтобы загрузить ДНК на матрицу спиновой чашки.

После центрифугирования снимите отжимные чашки, выбросьте фильтрат и поместите чашки обратно в пробирки для сосудов. Добавьте 500 микролитров одного буфера для промывки с высоким содержанием соли. Закройте пробирки крышками и снова поставьте центрифугу после центрифугирования.

Выбросьте фильтрат и снова поместите стаканчики обратно в пробирки. Теперь добавьте 500 микролитров 80% этанола. Закройте трубку крышкой и вращайте при давлении 14 000 G в течение одной минуты.

Повторите промывку этанолом еще два раза после третьей промывки в 80% этаноле еще раз, выбросьте фильтраты. Установите на место присоски в пробирках и на этот раз отжимайте в течение двух минут, чтобы высохла волокнистая матрица. Теперь переложите отжимные стаканчики в 1,5 миллилитровые пробирки для сбора.

Добавьте 100 микролитров эволюционного буфера в каждую чашку для отжима непосредственно на волоконную матрицу внутри чашки. Затем защелкните крышки пробирок для сбора на чашках и инкубируйте их при комнатной температуре в течение одной минуты. После инкубации вращайте образцы на максимальной скорости в течение одной минуты.

Далее выбросьте отжимную чашку и закройте трубки крышкой. Если измерить концентрацию ДНК, то ожидается концентрация в диапазоне от пяти нанограммов на микролитр до 500 нанограммов на микролитр. В настоящее время ДНК может храниться при температуре 4 градуса Цельсия до одного месяца для длительного хранения, при этом ДНК может храниться при температуре минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию.

Проведите ПЦР с использованием праймеров и реагентов, входящих в набор реагентов P-C-R-R-F-L-P. Согласно прилагаемому письменному протоколу, рекомендуется запускать каждый образец, включая положительный анти-ну-матричный контроль, в двух экземплярах во время проведения ПЦР. Приготовьте мастер-смеси ферментов рестрикции для разложения с DTE E одним HAE и NL тремя, соединив следующие компоненты по порядку: 1,5 микролитра стерильной дистиллированной воды, 0,5 микролитра 10 ферментного буфера и 0,5 микролитра 10 x фермента.

Подготовьте достаточно для всех образцов плюс один реакционный объем, избыток четыре три реагента смеси. Затем распределите по 2,5 микролитра в каждую реакционную пробирку, помеченную образцом и названием фермента. После завершения ПЦР извлеките образцы из термоамплификатора и положите их на лед.

Добавьте по 2,5 микролитра каждого продукта ПЦР в каждую из трех пробирок для рестрикционного расщепления для этой реакции. DDE один HAE три, а NLA три. Следующий вихрь.

Кратковременно центрифугируйте и инкубируйте разложения при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Если это удобнее, пищеварение также можно инкубировать в течение ночи. После пищеварения инкубируйте реакции при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Затем добавьте по одному микролитру 60 миллимолярного ЭДТА в каждую пробирку, чтобы завершить реакцию и вихрь. С помощью набора реагентов биоанализатора Agilent подготовить и загрузить рестрикционный дигест в лунки ДНК-чипа А в соответствии с инструкцией по набору. Для каждого образца все три дайджеста должны быть загружены на один чип.

Затем сделайте чип вихревым и загрузите его в машину. После завершения прогона перейдите в контекст анализа и выберите вкладку сводки по чипам. В поле Имя образца введите имя образца для всех 12 лунок чипа, чтобы идентифицировать виды рыб для тестовых образцов ДНК.

Запустите программу декодера RFLP, нажав на файл. Затем откройте файл XAD. Откроется открытое диалоговое окно.

Теперь выберите файл XAD для используемого чипа ДНК. И нажмите «Открыть», чтобы увидеть список образцов, загруженных на чип. Выберите три дайджеста, соответствующих первому образцу ДНК.

В столбце ферментов укажите ферменты рестрикции, которые были использованы, в поле, помеченном как минимальная пиковая высота в процентах от нижнего маркера. Значение по умолчанию — 10%, если нужно. Это значение может быть снижено для выявления небольших пиков, которые были пропущены или повышены, чтобы отбросить пики, возникающие в результате неспецифического шума на электроферограмме.

После внесения любых корректировок в значение минимальной пиковой высоты нажмите кнопку «Повторно интегрировать». Теперь нажмите calc в нижней части диалогового окна. Данные о длине фрагментов, полученные в результате работы биоанализатора, будут заполнены программными полями.

Далее в выпадающем списке очков в левом верхнем углу экрана выберите кубики. Если проба рыбы состоит из одного вида рыбы или смеси, если проба может состоять из смеси, таблица в нижней части экрана будет помечена списком комбинированных очков. Лучшие виды подбираются по результатам всех трех реакций пищеварения.

Идеальные совпадения со счетом один подсвечиваются зеленым цветом. Ближние матчи выделены желтым цветом в верхней части экрана. Нижнее пороговое значение обозначает минимальный размер фрагмента, используемый в анализе, а значение допуска совпадения определяет, насколько близким по длине должен быть фрагмент к прогнозируемому фрагменту, чтобы считаться совпадающим.

Отображаемые значения являются настройками по умолчанию и могут быть скорректированы. Повторите эти шаги для анализа оставшихся образцов ДНК на кончике. Образцы ДНК четырех различных видов рыб были изолированы, амплифицированы и переварены с использованием метода, описанного в этом видео.

Здесь показан гель биоанализатора, показывающий образцы рестрикционного расщепления, с помощью биоанализатора Agilent и декодера RFLP. Для идентификации рыбы здесь используются программные шаблоны гибки. Первый образец правильно идентифицируется как форель, второй – как тунец, третий – как скальный грунт.

И последний образец в качестве специфической трески. Мы только что показали вам, как проводить идентификацию видов рыб на основе ДНК с помощью метода P-C-R-R-F-L-P компании Agilent. При выполнении этой процедуры важно избегать перекрестного загрязнения образцов, так как метод очень чувствителен.

Вот и все. Теперь вы знаете, как быстро, легко и точно идентифицировать виды рыб, присутствующие в ваших образцах. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.