Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подготовить и запустить 384 тестовые пластины для высокопроизводительного анализа высокогомологичной группы генов, такой как подтипы интерферона первого и третьего типов. Это достигается путем предварительного приготовления стандартного серийного разведения, используемого для прогонных пластин. Далее подготавливается грунтовочный щуп и смеси рабочего материала без шаблонного контроля, используемые для изготовления пластин.

Затем с помощью автоматизированного многоканального дозатора подготавливаются пробирные планшеты 384 лунок и они высушиваются для хранения. Наконец, 384 скважинные пробирные пластины пропущены и проанализированы. В конечном счете, высокопроизводительный количественный анализ ОТ-ПЦР R в реальном времени используется для определения сигнатур экспрессии интерферона в моделях культур тканей, изучении патогенов или в клинических образцах в контексте инфекционных или аутовоспалительных заболеваний.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как количественная ПЦР с использованием стандартных линейных зондов или cyberg green, заключается в том, что флуоресцентные зонды молекулярного маяка и блокировки нуклеиновых кислот могут быть использованы для различения различий в одной паре оснований между очень похожими последовательностями После размораживания, вортексирования и кратковременного центрифугирования стандартной спермы и спермы лосося или S-S-D-N-A. Приготовьте водную смесь SSD NA для 17 стандартных наборов разбавления, смешав 51 микролитр S-S-D-N-A с 20,3 миллилитрами воды. Нанесите 190 микролитров водной смеси SS DNA в первую пробирку ПЦР-полоски из восьми пробирок и 180 микролитров в следующие пять пробирок.

Выполните разведение один к 20, переложив 10 микролитров из стандартного запаса 50 Picomolar в пробирку со 190 микролитрами воды S-S-D-N-A, смешайте вихрь и быстро центрифугируйте. ПЦР-полоски выполняют разведение от одного до 10 путем переноса 20 микролитров из самой последней разведенной пробирки в следующую пробирку в серии вихревых и быстро центрифугируют ПЦР-полоску. Повторяйте разведение от одного до 10 до тех пор, пока последняя пробирка в серии не получит стандарт.

После маркировки до 17 двухмиллилитровых пробирок с помощью электронной многоканальной пипетки объемом 12,5 микролитров добавьте два микролитра S-S-D-N-A в каждую пробирку с помощью праймеров и зондов, подготовленных в соответствии с текстовым протоколом. Добавьте соответствующий прямой праймер, обратный праймер и щуп к каждому праймеру. Зонд установки трубки рабочего материала для приготовления смесей рабочего материала без шаблона или NTC.

Переведите 14,3 микролитра из каждого комплекта грунтовочного щупа в соответствующую пробирку для смешивания рабочего материала NTC в соответствии с этой таблицей. После удаления Eloqua из набора праймерных щупов необходимый для NTC рабочий состав смешивается с 1,5 миллилитрами воды, чтобы довести конечный объем каждого набора праймерных щупов рабочей пробирки рабочего состава до 1,7 миллилитров. Для приготовления 96 лунки исходной плиты из комплектов грунтовочных щупов и НТК смесей.

Поместите новую 96-луночную пластину в охлаждаемый блок охлаждения 96 лунок и обозначьте лунки с правильным набором грунтовочных щупов или смесью NTC с помощью электронной многоканальной пипетки объемом 250 микролитров. Добавьте 66 микролитров воды в каждый набор грунтовочных щупов. Скважина выдает 82,5 микролитра воды в четыре целевые 17 скважин

Вылейте 27,5 микролитров воды в каждую смесь анти-C. Затем добавьте 54 микролитра правильных праймерных зондов на рабочем материале к назначенным праймерным зондам на дозаторах лунок. 67,5 мкл целевого 17 праймерного щупа рабочего набора набора на назначенную мишень 17 праймерных зондов на скважинах.

Добавьте в предназначенные лунки 22,5 микролитра правильной смеси рабочего состава НТЦ. Затем с помощью клейкой пластины герметизируйте 96-луночный планшет и центрифугируйте в течение одной минуты при 700 Gs, чтобы убедиться, что содержимое находится на дне лунок с помощью адаптера 96 лунок. Поместите пластину в вихревой миксер и перемешивайте при 1000 RP в течение одной минуты.

Затем центрифугируйте планшет при давлении 700 G в течение пяти минут. Для подготовки 384 луночных пробирных пластин включите автоматизированный многоканальный дозатор и дважды кликните по иконке программы, чтобы открыть протокол изготовления интерфероновых пробирных пластин для настройки платформы. Поместите полностью заполненную коробку с наконечником для пипетки в положение 1 платформы, исходную пластину на 96 лунок в четвертое положение и новую пластину на 384 лунки в шестое положение.

Начните прогон, нажав кнопку воспроизведения после завершения прогона. Осторожно постучите пластиной для анализа 384 лунок по плоской поверхности, чтобы убедиться, что жидкости находятся на дне лунок, и наложите клейкое уплотнение пластины после вращения пластины при давлении 700 G в течение одной минуты. Снимите пломбу с клейкой пластины.

Поместите пластину для анализа 384 лунок в сушилку для планшетов и расположите коллектор 384 лунок непосредственно над лунками. После 384 луночных пробных планшетов содержимое высыхает. Нанесите новую пломбу на клейкую пластину, быстро наклейте этикетку из фольги и храните в темноте при температуре четыре градуса Цельсия до использования для загрузки и запуска пластины для анализа.

Приготовьте два домашних гена или HKG хорошо смеси, разбавив два микролитра S-S-D-N-A в 84,9 микролитрах воды. Затем добавьте два микролитра разбавленного SSD NA 11,8 микролитров воды, 23 микролитра мастер-смеси и 9,2 микролитра правильного набора праймерного зонда 20 XHKG в каждую меченую пробирку HKG, вихревую и кратко центрифугируйте после подготовки образцов и положительного контроля CDNA в дозе 78,8 микролитров мастер-смеси и 54,8 микролитров воды на каждый образец объемом 24 микролитра и положительную контрольную пробирку. Для приготовления стандартов и скважинных смесей NTC добавить в высушенную 384 луночную пробирную пластину добавить 165 микролитров воды на 275 микролитров мастер-смеси в 1,5-миллилитровую пробирку, для NTC хорошо перемешать 52,5 микролитра воды на 52,5 микролитра мастер-смеси в 1,5-миллилитровой тубе

Снимите заранее подготовленную высушенную 384 лунку с пробирной пластиной от четырех градусов Цельсия и центрифугируйте при 700 GS в течение одной минуты. С помощью электронного многоканального дозатора объемом 30 микролитров дозируется 7,5 микролитров NTC. Хорошо перемешиваем к каждому НТЦ.

Хорошо дозируйте шесть микролитров стандарта, хорошо перемешайте и по 1,5 микролитра стандарта на каждый стандарт. Затем распределите 7,5 микролитров образца в предназначенные для этого лунки с помощью электронной многоканальной пипетки объемом 12,5 микролитров. Диспонируйте 2,5 микролитра смеси праймера HKG в предназначенные лунки после использования оптической клеевой пленки для герметизации пластины и центрирования при 700 G в течение одной минуты запечатайте 384-луночную пластину в вихревом смесителе при 2 600 об/мин в течение двух минут и центрифугируйте при 700 сыре в течение пяти минут.

Наконец, поместите запечатанную пробирную пластину в аппарат Q-R-T-P-C-R. Откройте шаблон для раскладки пробы и используйте следующие условия реакции. Начните прогон, экспортируйте и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом, как показано на этом рисунке, сигнатуры экспрессии интерферона первого и третьего типа человека были проанализированы в мононуклеарных клетках периферической крови или p BMC от шести доноров, стимулированных лигандами толл-подобных рецепторов.

Данные представлены в виде радарных диаграмм в логарифмической шкале с использованием двух методов анализа, включая абсолютное значение CQ, нормализованное к гену домашнего хозяйства, и количество копий матрицы на микрограмм общей РНК. Данные показывают, что сигнатуры экспрессии интерферона человека, вызванные агонистами TLR, являются лиганд-специфичными сигнатурами экспрессии интерферона первого и третьего типов у Resus Maccas. Поскольку в этом эксперименте лиганд TLR также был специфичен, PBMC от трех доноров стимулировали тремя лигандами в течение трех часов.

Экспрессия подтипа интерферона в нестимулированных клетках на исходном уровне была низкой, как показано здесь. Ограниченное число подтипов интерферона альфа экспрессировалось в ответ на ЛПС и полиихик. Напротив, экспрессия интерферона в ответ на имиквимод была высокой, а экспрессия подтипа была широкой экспрессией интерферона бета и интерферона.

Лямбда-1 была усилена всеми тремя агонистами TLR После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить, запустить и analyze. 3D четыре планшета для анализа высокой пропускной способности очень похожей группы генов, таких как подтипы интерферона первого и третьего типов.