PCR: La reacción en cadena de polimerasa

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

La reacción en cadena de polimerasa, o PCR, es una técnica utilizada para amplificar DNA a través de termociclaje rápido – cyles de cambios de temperatura en intervalos de tiempo fijo. Usando una polimerasa termoestable de la DNA, PCR puede crear numerosas copias de ADN de bloques de ADN llamado Dinucleósido trifosfatos o dNTPs. Hay tres pasos en PCR: desnaturalización, recocido y elongación. Desnaturalización es el primer paso en el ciclo y hace que el ADN derretir interrumpiendo enlaces del hidrógeno entre las bases en el ADN. Recocido disminuye la temperatura suficiente para permitir a la Unión de las cartillas del oligonucleótido a la plantilla de la DNA. Durante la elongación paso polimerasa de la DNA sintetiza nuevo ADN de doble hebra.

Este video proporciona una introducción al procedimiento de PCR. Se describen los principios básicos de la PCR así como un procedimiento paso a paso para configurar una generalizada reacción de PCR. El video muestra los componentes necesarios para una reacción de PCR, incluye la instrucción para el diseño de la cartilla y proporciona consejos útiles para garantizar el éxito reacciones de PCR.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. PCR: La reacción en cadena de polimerasa. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La reacción en cadena polimerasa o PCR es un método ampliamente usado para amplificar fragmentos de ADN. PCR utiliza termociclaje rápido, que es el repetido calentamiento y enfriamiento de la reacción a través de tres temperaturas distintas, llamada desnaturalización, recocido y extensión o alargamiento.

La reacción de termociclaje rápido comienza una vez que los reactivos de PCR se ponen en un termociclador una máquina, que está programada para precisamente calentar y enfriar la reacción.

El ciclo PCR comienza con la desnaturalización, que se produce de 20 a 30 segundos a 95° C, muy por encima de la temperatura de fusión del ADN. La temperatura de fusión es un estado donde la mitad del ADN es una doble hélice trenzada y el otro es una solo trenzada bobina al azar. La temperatura de desnaturalización es muy por encima de la temperatura de fusión, con el fin de asegurar que todos los enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarios se rompen produciendo sólo solo DNAs trenzados. Solos filamentos apareados se llaman las hebras sentido y antisentido. La secuencia del sentido, codificación o filamento, es idéntica a la secuencia de ARNm, que en última instancia será código para la proteína. Por lo tanto, tiene sentido. Cuando se lee de izquierda a derecha se comienza con el fosfato 5' y termina con el hidroxilo 3'. La hebra antisentida es también llamada el filamento complementario y comienza con 3' hidroxilo y termina con el 5' fosfato cuando se lee de izquierda a derecha.

En el segundo paso, recocido, corta trozos de ADN llamados iniciadores, que son específicos de las cadenas de sentido o antisentido se unen mediante enlaces de hidrógeno. La cartilla que se une a la hebra antisentida y tiene la misma secuencia como la cadena con sentido es el primer avance o sentido. La cartilla que se une a la cadena con sentido y tiene una secuencia inversa y complementaria a la hebra de sentido es su primer revés o antisentido. Dependiendo de la longitud de los primers utilizados, la temperatura de recocido para este paso es generalmente 3 a 5 ° C por debajo de la temperatura de fusión más bajada de sus dos iniciadores. Recocido tiende a ocurrir entre 50 y 65 ° C y tiene una duración de 20 a 40 segundos.

Una vez que los cebadores se unen a ADN que ceba la reacción mediante la creación de un extremo 3' hidroxilo grupo al que se unirá una polimerasa, una enzima que replica el ADN.

El siguiente paso se llama alargamiento o extensión ocurre a 72° C, óptima para la actividad de la polimerasa. Una vez enlazado la polimerasa comienza a añadir trifosfatos de nucleótidos libres, o dNTPs, a los extremos del primer en un momento en el 5' a 3' dirección para hacer doble trenzado DNA.

Una vez completa la elongación comienza el próximo ciclo. En el siguiente ciclo de cartillas se unirán al único trenzado DNA formado a través de la extensión anterior. El fragmento corto que intenta amplificar, el amplicon, formarán en última instancia, cuando la polimerasa se extiende desde el primer delantero en un filamento que se generó por la amplificación de la cartilla inversa o viceversa. Una vez generados, la cantidad de amplicón aumentará exponencialmente en ciclos posteriores. Dependiendo de la meta de su reacción, se necesitarán 20 a 40 ciclos.

Para amplicones de largo, un paso de elongación final normalmente se ejecutan a 72° C durante 5 a 15 minutos para asegurar que todo ADN es doble trenzado. Generalmente, un paso final mantener a 4° C se programa en el termociclador como medida cautelar para asegurar que el ADN permanece estable hasta que sacan el termociclador.

La reacción de PCR requiere varios reactivos claves. En primer lugar es la plantilla de ADN, que es la muestra de ADN que se amplificarán su fragmento. Entonces son sus iniciadores, que son los pedazos cortos de ADN o de oligonucleótidos que ceba la reacción de la polimerasa.

Hay varias consideraciones importantes que deben tomarse a la hora de elegir sus cartillas. En primer lugar, deben ser complementarios a las regiones 5' y 3' de la plantilla de ADN que flanquean la secuencia que se desea amplificar. En segundo lugar, que deben estar entre 15 y 30 pares de bases largo y conformadas por cerca de 50% los guanines y cytosines. En tercer lugar, la temperatura de fusión de ambos iniciadores debe estar por encima de 50° C y dentro de uno o dos grados de cada uno eficientemente puede enlazar a la misma temperatura de recocido. En cuarto lugar, que no pueden ser complementarios entre sí y forman dímeros de primer. Y en quinto lugar, no deben contener estructura secundaria, que es la forma de uno mismo-recocido dentro de uno de los iniciadores.

Además de las cartillas y plantilla de la DNA, la polimerasa de la DNA es esencial para la reacción de PCR. La enzima más utilizada en PCR es la Taq polimerasa, que es una enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus que hace su casa en manantiales de agua caliente. Taq polimerasa puede soportar temperaturas superiores a 90° C.

Trifosfatos de Dinucleósido o dNTPs, que estará integrado por los pares de bases en los filamentos cada vez mayores, también se debe añadir a la reacción. Un tampón de reacción, que mantiene el pH y contiene importantes iones como manganeso, magnesio y potasio, también es un componente necesario de la reacción que estabiliza la reacción y brinda importantes cofactores de la enzima polimerasa. Como todas las reacciones, PCR necesita un disolvente y así agua grado PCR, que es libre de iones que pueden inhibir la reacción, se utiliza.

Antes de comenzar la PCR Asegúrese de que el ambiente de trabajo esté limpio para evitar la contaminación. Siempre deben llevarse guantes.

Para ayudar a realizar un seguimiento de los distintos componentes de la reacción que usted necesita. Hacer una tabla de volúmenes de reactivo y concentración para cada una de sus muestras incluyendo los controles. En términos de volúmenes, una reacción típica debe contener 5μL de 10 X buffer de reacción, 4μL de 25 mM MgCl2, 1μL de dNTPs en 10 mM, 2μL de cartillas de avance y retroceso a 50 ng/μL y 0.3μL de la Taq polimerasa a 5 U/μL. Desea agregar suficiente plantilla para que 100 ng está presente en la reacción. Finalmente, la mayoría de las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50μL. Así que debe usarse un volumen de agua de grado de polimerización en cadena para asegurar que el volumen total es de hecho, 50μL.

Una vez que su reacción está previsto sobre el papel montar sus reactivos en el hielo.

A continuación añadir el reactivo al tubo de PCR. Primero agrega el agua, entonces su plantilla, sus cartillas, buffer, cloruro de magnesio y dNTPs, agregar último Taq polimerasa y mezclar bien.

Después de que su reacción es lugar de instalación la muestra en un termociclador y comenzar su programa PCR. Brevemente, partes de la máquina consiste en un termobloque, donde se inserta el tubo PCR o la placa y sujeto a cambios de temperatura. Una tapa caliente, que evita que la condensación por lo que ninguna muestra es perdida y una interfaz con una pantalla para la programación de las temperaturas de polimerización en cadena y las duraciones de ciclo. El programa de instalación siempre antes de montar la reacción.

Una vez que el termociclador ha hecho su trabajo. Saque su reacción y verificar el producto PCR con electroforesis en gel. Si la PCR se realiza correctamente, debería ver el amplicon en el tamaño correcto par de base.

Y ahora algunos consejos útiles al trabajar con PCR. Cuando intenta amplificar el mismo producto de la polimerización en cadena de un número de plantillas diferentes y por lo tanto, tiene un montón de diferentes reacciones al programa de instalación. Es útil para intensificar la reacción para crear una mezcla maestra. La mezcla PCR master es una mezcla de gran volumen de todos los reactivos compartida entre sus muestras, que posteriormente se distribuye en múltiples tubos de reacción.

Mayoría de las reacciones de PCR comienza con un paso de desnaturalización inicial, que ocurre a 95° C para 1 a 9 minutos. Este paso asegura que la plantilla es solo trenzado para el primer ciclo de amplificación.

A menudo es deseable utilizar un armario PCR cuando es alto el riesgo de contaminar su muestra. Para detectar cualquier contaminación en su reacción es beneficioso para configurar un control negativo, que no tiene ninguna plantilla de la DNA y no debe producir un producto en tu gel de DNA.

A menudo PCR debe ser optimizada por ajustar temperaturas, concentración de cloruro de magnesio, o tratar de nuevo cartillas. Una vez que tengas tu trabajo de PCR. Es una buena idea hacer siempre una plantilla de control positivo, que sabes que va a producir un producto.

Muchas variaciones y aplicaciones de la PCR existen para una variedad de propósitos.

Una variante de PCR, hot start PCR, consiste en retener la polimerasa de la reacción hasta que después del primer paso de desnaturalización, que impide la amplificación inespecífica que puede ocurrir antes de ciclismo.

Polimerización en cadena puede modificarse también para amplificar simultáneamente múltiples secuencias de ADN mediante el empleo de bases múltiples en una sola reacción de PCR, llamada PCR múltiplex.

En combinación con sondas de oligonucleótidos fluorescentes, PCR puede convertirse realmente en una técnica que permite medir niveles relativos o absolutos de la expresión génica o cuánto ARNm se produce para un determinado gen o grupo de genes. Este método se conoce como qPCR.

PCR también puede utilizarse para determinar la presencia de una secuencia particular de ADN en un organismo. Este procedimiento se conoce como genotipificación. Por ejemplo, genotipado puede utilizarse para determinar la autenticidad de las muestras de pescado por averiguar si una secuencia específica de la especie está presente en la muestra. Genotipificación se usa también en análisis forense para determinar si el ADN encontrado en la escena de un crimen coincide con un sospechoso.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la PCR. En este video repasamos lo que PCR es y cómo funciona, los muchos componentes de la reacción de polimerización en cadena, el mecanismo por el cual PCR puede amplificar ADN y muchas variaciones y aplicaciones de esta técnica de gran utilidad. ¡Gracias por ver!

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