凝胶纯化

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

胶纯化用于回收电泳分离的DNA片段。从琼脂糖凝胶中回收DNA包括三个基本步骤:在硅胶柱上进行结合,清洗和洗脱。高盐环境下,DNA会通过盐桥结合到硅胶上,清洗掉不纯的物质后,再用低盐条件破坏这种相互作用从而将DNA洗脱下来。

本短片讲述了常用胶回收的基本步骤,从胶中将DNA带切割出来,溶解胶,用硅胶柱结合并洗脱下纯化的DNA。此外,该短片还讨论了要保证胶回收成功的几个技巧,包括跑胶中用上已知分子量大小的DNA标准样的重要性。

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JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 凝胶纯化. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

胶纯化是用来在琼脂糖凝胶中回收电泳分离的DNA片段的标准步骤。将胶溶解后,让它通过一种特殊的滤膜,这一步骤使得DNA与其他杂质,如盐,游离核苷酸,酶等分离开,从而可以进行下游的应用操作。

从琼脂糖凝胶中回收DNA的基本原理涉及到一系列的结合,清洗和洗脱步骤。当胶完全溶解在溶解缓冲液中后,上样到一个“离心柱”上,它通过离心可使DNA分子特异性的结合到硅胶膜上,而其他的杂质则通过柱子到了收集管。

由于凝胶溶解缓冲液中的高盐浓度,使得DNA可以结合到硅胶上。该缓冲液会破坏膜周围的水合结构,在强阴性的膜和阴性的DNA之间建立一个阳离子盐桥。剩余的杂质则被乙醇清洗去掉。

水或低盐缓冲液加到柱子上,被认为会打断阳离子盐桥而将DNA洗脱下来。这样DNA就从胶中被纯化出来。

胶纯化步骤中的第一步是要制备琼脂糖凝胶和对DNA样品跑电泳。跑胶完成后,在紫外灯下观察DNA片段并通过与分子量标准样进行比较来选择要回收的片段。

如果凝胶未被染色,可通过DNA标准样来大致判断带的位置。当用刀片切割胶时,要一定小心用尽可能小体积的凝胶回收到尽可能多的DNA样品。

使用溴化乙锭染色凝胶和在紫外灯前操作时,必须要带上手套和防护眼镜。将目的DNA从凝胶中切割出来后,要依据实验室安全条例步骤正确地处理凝胶和跑胶溶液。

将切割下来的胶条放在一个微量离心管中并在电子称上称重。100毫克的胶重被大致算作100微升体积,将4倍于胶重体积的溶解缓冲液加入含胶条的小管。然后放置在50度孵育来熔化胶。

胶熔化后,将它们加入到离心柱上,离心去掉溶液,这样所有的DNA和其他的颗粒都附着到了滤膜上。

接下来,在滤膜上加入70%乙醇并离心来清洗结合的DNA,去除滤膜上残余的杂质。弃去洗脱物,重复该清洗步骤三次。再将空的滤膜离心一次来去除所有剩余的乙醇,将硅胶滤膜放室温下晾干。最后,加入水或洗脱缓冲液到滤膜并离心,纯化的DNA就被收集到了管子的底部。

您刚看到的是使用硅胶滤膜离心管来进行胶纯化。还有其他的方法也同样用到了DNA先与硅胶结合,然后进行清洗和洗脱的原理。例如,DNA可与被称之为玻璃奶的硅胶悬液混合,然后将其离心下来,清洗,再进行洗脱。此外,也可以使用抽真空的方式来让DNA通过硅胶膜,然后洗脱。一定要了解您所在实验室用到的胶回收流程。

现在,您已经学习了如何从琼脂糖凝胶中回收DNA。让我们再来看看对这些胶回收的DNA的下游的一些应用。

例如,胶纯化可以是染色质免疫沉淀中的一个中间步骤,该技术是用来分离与基因组DNA结合的调节蛋白,从而可以判断哪些序列受到调控。将分离得到的片段进行胶纯化并进行测序,这样可将它们定位到各自的染色体区域。

亚克隆, 是一种将基因从一个载体转移到另一个载体的过程, 其中也会用到胶纯化。例如,一个载体上的基因序列会酶切下来,然后通过PCR嵌合上其他序列,再被胶纯化并插入到其他载体上。

胶纯化最简单的应用也许用它来回收-80度长期保存的电泳后切割下来的DNA。

您现在已经了解了如何从琼脂凝胶中回收DNA片段,根据不同要求来改动结合,清洗和洗脱流程,以及该方法下游的一些应用。我们一如既往地感谢您的观看。

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