La purification à partir d'un gel

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

La purification sur gel est utilisée pour récupérer des fragments d'ADN après séparation par électrophorèse. La récupération d'ADN à partir d'un gel d'agarose inclu trois étapes de base: la liaison, le lavage et l'élution depuis une colonne de silice. Il est communément accepté que l'ADN se lie à la silice en présence d'une haute teneur en sel via un pont salé. Après la liaison, l'ADN est lavé des impuretés et élué sous des conditions faible en sel perturbant cette interaction.

Cette vidéo passe en revue une procédure généralisée étape par étape pour la coupe d'une bande de gel, la solubilisation du gel, la purification via l'attache à une colonne de silice et l'élution de l'ADN purifié. En plus, la présentation parle de plusieurs conseils pour assurer le succès de la purification à partir de gel, incluant l'importance de l'exécution d'un gel d'agarose avec un marqueur ou une échelle qui a l'ADN de tailles connues.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. La purification à partir d'un gel. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La purification sur gel est une procédure standard pour récupérer les fragments d'ADN désirés, depuis des gels d'agarose, après séparation par électrophorèse. Après dissolution du fragment de gel et son passage à travers un filtre spécialisé, cette procédure laisse l'ADN libéré des impuretés telles que les sels, les nucléotides et enzymes libres, et prêts pour des utilisations ultérieures.

Le principe de base derrière la récupération d'ADN à partir d'un gel d'agarose implique une séquence d'étapes d'attache, de nettoyage et d'élution. Une fois que le gel est en tampon de solubilisation, il est versé dans un microtube colonne, qui dans la centrifugeuse, permet aux molécules d'ADN de se lier sélectivement à un filtre de silice pendant que les impuretés s'écoulent vers un tube collecteur.

L'ADN est capable de se lier à la silice grâce à une haute concentration en sel dans le gel tampon de solubilisation. Ce tampon est connu pour interrompre la structure d'hydratation autour du filtre et créer un pont de sel de cation entre les charges négatives fortes sur le filtre et les charges négatives sur l'ADN. Les impuretés résiduelles sont retirées par un lavage à l'éthanol.

De l'eau ou un tampon faible en sel est ajouté à la colonne et va “éluer”, ou libérer, l'ADN, vraisemblablement par l'interruption du pont cationique. L'ADN est maintenant purifié à partir du gel.

La première étape dans la procédure de purification sur gel implique la fonte du gel d'agarose et la réalisation de l'électrophorèse des échantillons d'ADN. Une fois que l'exécution du gel est terminee, les fragments d'ADN désirés sont visualisés sous lampe UV et les fragments sont sélectionnés après comparaison avec un standard de poids moléculaire.

Si le gel est immaculé, la localisation de la bande peut être appoximativement déterminée sur la base d'une comparaison à l'échelle d'ADN. Tout en coupant le gel avec une lame de rasoir, il faut prendre soin de récupérer autant d'ADN que possible avec aussi peu d'agarose que possible.

Lors du travail sous lampe UV et de la manipulation de gels de bromure d'éthidium colorés, des gants et des lunettes de protection doivent être portés. Après la récupération de l'ADN désiré depuis le gel, jetez le gel et le tampon correctement, en respect des protocoles de sécurité institutionnels.

Une fois isolé, le morceau de gel est placé dans un microtube et pesé sur une balance. En utilisant l'approximation que 100 mg de gel occupe 100 µl, un volume de tampon de solubilisation de 4 fois le poids du gel est ajouté au morceau de gel. Après avoir été placé dans un tampon, le morceau de gel est incubé aux environs de 50°C pour faire fondre l'agarose.

Une fois fondu, le gel solubilisé est ajouté à un microtube colonne et la solution est centrifugée, ce qui aura pour effet de coller l'ADN et les autres particules au filtre.

Ensuite, l'ADN lié est lavé, grâce à l'ajout de 70% d'éthanol au filtre, suivi d’une centrifugation qui va retirer les impuretés résiduelles du filtre. L'écoulement à travers le filtre est rejeté, et cette étape de nettoyage est généralement répétée jusqu'à trois fois. Le filtre vide est à nouveau centrifugé pour retirer l'éthanol résiduel, et le filtre de silice est seché à température ambiante. De l'eau ou un tampon d'élution est ajouté au filtre, et avec un autre tour de centrifugation, l'ADN purifié est collecté au fond du tube.

La méthode que vous venez de voir s'applique à la purification sur gel avec des filtres de silice dans des microtubes colonne. D'autres méthodes existent qui utilisent les mêmes principes de base d'ADN lié à la silice suivi par les étapes de lavage et d'élution. Par exemple, la silice peut être mélangée avec de l'ADN dans une suspension appelée “glassmilk”, qui peut être granulée et lavée, et plus tard éluée. D’autre part, on peut utiliser une succion pour sortir l'ADN à travers les filtres de silice, avant de l'éluer. Soyez certain de comprendre les procédures de purification de votre gel de labo.

Maintenant que vous avez appris comment récupérer l'ADN à partir des gels d'agarose, examinons quelques applications actuelles qui utilisent l'ADN obtenu par purification sur gel.

Par exemple, la purification sur gel est une étape intermédiaire de l'immunoprécipitation de chromatine, une technique qui vise à isoler les protéines de régulation qui empaquetent l'ADN génomique, en vue d'identifier quelles séquences sont régulées. Les fragments isolés sont purifiés sur gel et séquencés, en vue d'être cartographiés dans les régions chromosomiques individuelles.

Le sous-clonage – le processus de déplacement d'un gène d'un vecteur vers un autre – peut impliquer la purification sur gel. Par exemple, les séquences de gène d'un vecteur peuvent être digérées depuis une construction, et assemblées dans des séquences chimériques via PCR, après quoi elles sont purifiées sur gel et placées dans d'autres constructions.

L'utilisation la plus simple de la purification à partir de gel est peut-être son utilisation après un stockage à long terme à -80 °C de bandes d'ADN coupées suite à une électrophorèse.

Vous venez d'étudier comment extraire les fragments d'ADN depuis un gel d'agarose, les variations de procédures d'attaches, de lavages, et d'élution suivis par les préférences d'utilisateurs individuels. Enfin, vous avez appris certaines utilisations possibles de cette méthode. Comme toujours, merci pour votre attention!

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