酵母的转化和克隆

Biology I

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Summary

酿酒酵母是在生物学研究中常用到的一种单细胞真核生物。在实验过程中,研究人员主要依靠转化(细胞摄取外源DNA)这一基本技术来控制基因表达,引入基因缺陷,表达重组蛋白和标记亚细胞结构。

本短片介绍在实验室里如何操作酵母转化和为何进行转化。我们将讲述酵母质粒的一些重要特性,以及处理酵母细胞接受新的质粒所需的步骤。短片还包括了用醋酸锂法转化酵母的详细步骤。最后是介绍一些这一基本技术的实际应用例子。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 酵母的转化和克隆. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

酵母或酿酒酵母作为一种普遍用于遗传学和细胞生物学研究的简单真核模式生物能有助于深入了解人类细胞进程。今天的视频将讨论转化-也就是酵母细胞摄取外源DNA。我们将介绍酵母质粒,如何准备用于转化的酵母细胞以及详细的转化步骤。还会介绍这个基本技术的一些实际应用。

在介绍酵母转化之前,我们先来讨论一下用于转化的DNA:质粒。质粒是一种小分子的环状双链超螺旋DNA, 因而非常容易通过细胞膜上的膜孔。

质粒带有一个能被限制性内切酶酶切的多克隆位点(MCS)。用相同内切酶酶切的DNA片段能够连接到酶切过的多克隆位点处。质粒还含有确定开始复制质粒位置的复制原点(ORI)。另外,质粒还有选择标记能使含有该质粒的酵母细胞在特定环境下生长。未携带该质粒的酵母无法在选择培养基上生长的。这些选择标记可以是耐药性基因或者是编码某氨基酸的基因,使得其缺陷型酵母株系能合成该氨基酸。

穿梭载体是指能在多个不同宿主种属内复制的载体。如既可在大肠杆菌中也可在酵母中复制的载体。酵母载体可以是非整合型的或整合型的。也就是质粒既可以整合到基因组DNA中也可以独立存在。

通常用于酵母的质粒或载体有五种。最常用于转化酵母细胞的两个是酵母游离质粒YEp和酵母着丝粒质粒YCp。这两个质粒都含有自发复制序列ARS,自发复制序列含有复制原点,使之能在酵母内独立于染色体进行复制。

目前有几种不同的方法用于酵母转化,包括原生质体法,电转和醋酸锂转化。在这个视频里我们将着重于醋酸锂法。

醋酸锂法是利用带有正电荷的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷。转化混合物中的单链DNA将结合到细胞壁上,因而仅剩质粒DNA能被酵母细胞摄取。 然后利用突然增温或称之为热激的方法造成细胞内外压力差在细胞壁上形成小孔让质粒进入。一旦温度降下来,酵母细胞壁恢复,转化完成。

现在我们开始一步步准备用于转化的酵母细胞。先从琼脂平板上挑取酵母细胞,然后用酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基YPD-一种酵母生长的完全培养基-来扩增克隆。

在平板上挑出克隆到YPD培养液中,然后在摇床或旋转器上30°C培养过夜。接下来就像这里看到的,离心酵母细胞去上清留沉淀。然后用相应的缓冲液或者蒸馏水重悬,这样准备的感受态细胞将被用于转化。

酵母细胞准备好以后,再来配制用于转化的预混物。

混合的试剂包括:蒸馏水,50%的聚乙二醇(PEG),1M的醋酸锂,10毫克/毫升的单链DNA,质粒DNA和感受态细胞。在实验前先根据实验室的标准方法算好每一组分的比例。

混好后置于30°C摇床30分钟,溶液应混匀而非震荡,以免酵母细胞破裂。

细胞置于42°C水浴热激15分钟。然后放冰上冷却2分钟。离心收细胞。

细胞用双蒸水重悬后涂板在含有载体相应抗性的选择培养基上。转化后的平板在30°C继续培养两到四天直到长出克隆。

在转化过程完全优化前,还应加有阳性和阴性对照。阳性对照是将质粒DNA转化后的酵母细胞涂在无选择性的完全培养基平板上生长,用于显示转化后的细胞健康正常。阴性对照是将转化的酵母细胞涂板在含相应选择性如抗生素平板上生长。阴性对照不应长出任何克隆以表示操作过程无污染。

酵母转化的应用方方面面五花八门。其中一个是用酵母双杂交系统来鉴定与我们的目的蛋白,也称诱饵蛋白,相互作用的蛋白。将来自候选结合蛋白文库的质粒转化酵母细胞,如果它编码的蛋白与诱饵蛋白有相互作用, 就会释放转录因子从而激活报告基因,如β-半乳糖苷酶。在含有β-半乳糖苷酶底物X-gal的平板上,报告基因会使含结合蛋白的阳性克隆变成蓝色。

另一个应用是通过性循环的技术手段来在酵母中造成多点缺失。含报告基因和缺失位点的单倍体细胞通过随机分配和减数分裂重组的方式整合成一个细胞。可以通过选择标记来筛选含有缺失的酵母细胞。还可以用流式细胞仪来筛选出表达绿色荧光蛋白的细胞。

酵母也可转化荧光标记的蛋白以观察突变对蛋白相互作用的影响。本短片用荧光显微镜研究了不同突变对在内吞中必需的蛋白间相互作用所造成的影响。

您刚刚观看的是JoVE提供的关于转化酵母的短片。您现在应该知道了一些关于质粒,如何准备转化用的酵母细胞和转化步骤的基本知识。一如既往地感谢您的观赏。

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