小鼠子宫内电穿孔

Neuroscience

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Summary

子宫内电穿孔是研究引导神经发育中的细胞增殖,分化,迁移和成熟的分子机制的一项重要技术。电穿孔利用电脉冲在细胞膜上产生瞬时孔隙,快速和有靶向地将物质导入到细胞中。 电穿孔在体外研究中的使用由来已久,但科学的发展将它的使用扩展到了完整的器官,如那些在子宫内的发育的小鼠胚胎器官。

本短片将介绍子宫内电穿孔背后的主要原理,回顾在怀孕的鼠体内操作发育中的胚胎所需的基本外科技术。并提供了注射和电穿孔的详细步骤,以及将基因导入指引到特定脑区域的重要因素。最后展示了子宫内电穿孔在神经生物学中的应用,如调查特定基因是如何参与神经系统的发育和发育中神经元之间是如何建立连接的。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 小鼠子宫内电穿孔. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

子宫内电穿孔是研究神经发育的分子机制的一项关键技术。通过注射DNA来改变发育中啮齿动物大脑的特定区域中基因的表达,研究人员能够研究神经细胞在其自然环境下的增殖,分化,迁移和成熟。

本短片将介绍子宫内电穿孔的主要原理,如何操作该技术的基本概述,以及它在神经生物学研究中的应用。

在深入介绍如何进行这项操作前,让我们先了解一下电穿孔的一些原理。这个过程利用了电脉冲能在细胞膜上产生瞬时孔隙,使得DNA能进入细胞。由于带负电荷的DNA会朝正极移动,可以根据不同细胞群在电场中的位置,来击中不同的目标细胞。

电穿孔在体外研究中的使用由来已久,但科学的发展将它的使用扩展到了完整的器官,包括那些在子宫内的发育的小鼠胚胎器官。

与细胞培养或离体技术不同,子宫内电穿孔的优点是,转染后的细胞将继续接受到所有引导正常发育的生理因子的信号。这点在大脑中尤为重要,因为其中的结构,例如轴突需要从其他细胞类型获得引导因子,以便正确地发育。

尤其是大脑发育涉及一系列程序化的增殖和迁移事件,这意味着不同的组织层能根据电穿孔的时间被设为目标。

最后,有各种不同类型的电极,使研究人员不仅能研究靠近大脑表面的区域,还可到达更深的区域。铲型电极被用在以大脑浅表部位,如皮质和海马为目标的实验中,而更小的针形电极被用于深部结构像丘脑和下丘脑的实验中。

现在,我们已经讨论了该技术背后的一些基本原理,让我们开始准备工作,使得能进一步进行外科手术和子宫内电穿孔。

首先,用70%乙醇消毒所有的仪器并擦拭手术台面。接下来准备注射溶液,用含0.1%快绿染料的无菌PBS溶液溶解质粒DNA。快绿染料的添加使得我们能够在胚胎中看到注射的溶液。最后,使用针头拉制器,制备出超细的针,以减少羊水的损失和随后的胚胎死亡率。

现在,我们已经准备好了所有的东西,让我们看看对发育中啮齿动物的脑组织进行电穿孔的基本步骤。首先,用5%的异氟醚麻醉怀孕的母鼠,在整个手术过程中都将其接上输送2.25%异氟醚的呼吸管。接下来,为了术后止痛,皮下注射镇痛药如丁丙诺啡。然后给腹部剃毛并消毒切口部位。

为了手术暴露子宫,先沿着皮肤的中线划一个垂直的切口,并用剪刀剪开腹膜。为防止胚胎失水变干,用被无菌生理盐水浸泡过的纱布覆盖开口。接着,轻轻地将胚链拉出腹腔,覆盖无菌预温的生理盐水以保持胚胎湿润。

使用解剖显微镜,找到胚胎的合适位置以方便操作大脑。用您的手指或镊子固定住胚胎的头部,将DNA溶液穿过子宫壁注入进大脑。在头部的每一侧放置一个电极,将正极放在您想要DNA电穿孔达到的方向。一旦所有位置都放好,就可对胚胎进行电穿孔了,然后小心地将子宫角放回到腹腔中。

在缝合切口前,加2 - 3毫升温热的生理盐水到腹腔中。用可吸收的缝线缝合腹膜,然后用钉书钉钉合皮肤。最后,将该鼠转移到含加热垫和监示器的笼子里。

现在,我们已经演示了如何进行子宫内电穿孔,让我们来看看这个技术的一些下游应用。

子宫内电穿孔是研究特定的基因如何在神经系统发育中发挥作用的一个有用的工具。电穿孔的载体可以介导过量表达野生型或突变蛋白,或者完全阻断蛋白的表达。然后可在微观或整个机体水平上对神经表型进行评估。例如,这些实验人员确定在发育小鼠的大脑中瞬时表达精神分裂症相关基因DISC-1,会造成小鼠今后对安非他明超级过敏。

子宫内电穿孔,对于可视化特定的细胞群及其建立的连接也非常有用,这通过将编码荧光蛋白的序列导入到神经组织中实现。例如,这些实验人员将绿色荧光蛋白基因通过电穿孔插入到E13.5胚胎期的视网膜中,用以研究视网膜神经节细胞RGC,RGC将视觉信息从眼睛传递到大脑。在E18.5胚胎期时检查视网膜显示了如何用该技术来示踪RGC轴突通过视神经,视交叉和视神经束的路径。

最后,神经发育的许多重要事件是在出生后发生的,这启发了科学家们开发了一种叫做体内电穿孔的改良技术。该过程遵循子宫内电穿孔相同的基本步骤,但它通常是在出生后的最初几天进行。产后遗传操作对研究后出生的细胞类型,如这里在嗅球中发现的细胞类型特别有用。

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