代谢标记

Biochemistry

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Summary

代谢标记用来探测生化转换和修改发生在一个单元格中。这被通过使用模拟天然生物分子的结构的化学类似物。细胞利用其内源性的生化过程,生产标有的化合物的类似物。该标签允许成立为法团的检测及亲和标签,然后可以用来阐明使用其他生化分析技术,如 SDS — PAGE 和核磁共振的代谢途径。

该视频介绍代谢标记和显示两个一般程序的概念。 第一个使用同位素标记法,来表征的一种蛋白质磷酸化。第二封面感光的标签来表征蛋白质-蛋白质相互作用的代谢标记也三个应用程序内介绍: 植物材料贴标 RNA 来衡量动力学,标签在胚胎发育中的糖。

代谢标记用来探讨机械的一个单元格。这被通过使用化学类似物探测的生化变化和发生的修改。本视频将显示代谢标记,典型的原则,同位素和感光贴标过程和一些应用程序。

可以使用一系列的战略进行代谢标记。在这里,我们将描述同位素、 感光,和生物正交标记。

同位素标记法使用执行的结构类似物与对应的天然,化学完全相同,但有罕见同位素纳入他们的结构。在这 L-赖氨酸模拟碳和氮原子所取代碳 13 和氮-15。同位素的类似物在细胞会将其纳入其生化结构。代谢产物的细胞从收集和分析净化。稳定同位素样品分析使用质谱法或核磁共振波谱法等技术。与放射性标签样本进行分析使用液体闪烁计数和 x 射线的电影,将在同位素标记协议进行演示。

感光标签是官能团纳入稳定直到接触到的紫外线光的蛋白质。官能团形成活性基,将绑定到的最近的蛋白质。一个常见的例子,L-照片-亮氨酸,包含 diazirine 的戒指,那是感光的交联剂。与同位素标记法,还有一些化学不同照片无功的化学类似物与自然同行之间。细胞可能优先纳入天然化合物在类似物。因此,它是重要执行照片无功标签中自由的这种化合物被模仿。一旦暴露在紫外线辐射,照片反应基团标记的蛋白质成为不稳定和高活性,使其与相互作用蛋白交联创建复杂的一种蛋白质。交联的配合物,作为快照,然后可以用 sds-PAGE 和质谱方法分析。这提供了洞察什么反应都发生在代谢途径的识别反应物种和他们如何通过确定绑定站点进行交互。

Bioorthogonal 贴标战略利用类似物与小有小到无反应性与自然生物分子的官能团。例如,叠氮化合物是小的官能团,其反应性据说是正交的生化反应。在测出结扎,磷化氢组攻击叠氮组。这将生成一个附近的酯,造成保税胺配体分子反应过渡态。Bioorthogonal 官能纳入生物分子可以与检测标记荧光的官能团,如结扎和亲和标记抗原等。

现在,讨论了一些概念和代谢标记的策略,让我们看看在实验室过程。

代谢的标记实验的第一步是收集感兴趣的蛋白质。为了做到这一点的细胞生长在盘子里,和一种表达方法用来促进所需的蛋白质合成。在此示例、 富含亮氨酸重复激酶或 LRRK,表示。磷酸氢二钠,含放射性磷-32,用作模拟。必须采取适当措施防止电离辐射。这包括设置工作区域、 穿着适当的防护装备,以及检查放射性污染。一旦采取了安全措施,被制备含有同位素类似物的介质。从文化媒介是删除,替换成一个含同位素化学类似物,然后孵化。后孵化,细胞的裂解。裂解是收集和净化。

纯化后用 SDS-PAGE,然后转移到聚偏氟乙烯膜解决蛋白质。放射自显影由暴露膜 x 射线胶片和用荧光粉成像仪测量。免疫印迹用于测量聚偏氟乙烯膜相关蛋白水平。在此示例中磷酸化水平的富含亮氨酸重复激酶在 293T 细胞测定中合成。Autoradiogram 显示多少磷被纳入蛋白质。免疫印迹阐明了 LRRK 蛋白的水平。图像分析软件用于获取的蛋白质磷酸化水平的定量数据。

在这接下来的过程中,证明感光标签。首先,编写、 培养细胞。感光模拟是中期日志阶段添加到单元格和孵化。在此过程中使用了 p-benzoylphenylalanine。样本收集超过间隔,放在冰上。样品然后暴露,随着时间的推移获取快照的生化途径。感兴趣的蛋白质是经过提纯和解决使用 SDS — PAGE。

感光的标签策略用于标识与感兴趣的蛋白质进行交互的化合物。免疫印迹表明蛋白条带,表明高分子量蛋白质与辐照样品中存在。这些是从蛋白质-蛋白质相互作用在 UV 照射期间发生交联。

既然我们已经回顾了代谢标记程序,让我们看看一些过程的使用的方式。

代谢标记概念可以扩展到多细胞生物。植物生长在一个密封的环境,丰富的生产标记的植物材料的稳定同位素。含有碳-13 的二氧化碳被添加到存储模块,而氮-15 使用丰富的肥料。由此产生的收获的植物材料可以帮助回答问题关于碳和氮循环的生态系统。

标记使新合成的 RNA 分离旧 RNA。通过改变初始浓度的模拟,可以确定新的 RNA 合成反应动力学。结果表明,4 thiouridine 浓度影响多少新的 RNA 转录。此外,可以用分光光度计直接量化成 RNA 标签注册率。

使用双正交点击化学,可以标记在斑马鱼胚胎中的糖。鸡蛋被注射炔烃标签上糖结果标记化合物。在幼虫糖然后结扎对染料化合物在预期的发展阶段。在胚胎中的糖然后成像。不同时间点产生的糖可以通过标记在胚胎发育的不同阶段使用不同的颜色识别。

你刚看了朱庇特的视频上代谢标记。这个视频描述背后代谢标记的概念以及它们的战略,走过去两个的一般程序,和涉及的一些技术的使用。

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 代谢标记. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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