タンデム質量分析法

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

タンデム質量分析法における関心の生体分子は生体試料から分離され、その組成とシーケンスを明らかにするために複数のサブユニットに断片化されました。これは、シリーズの質量分析装置を持っていることで。最初の分光計は、特定質量比を充電するためのサンプルとフィルター イオンをイオン化します。フィルター処理されたイオンは断片化し、フラグメントの分析、2 つ目の質量分析計に渡されます。

このビデオは、質量比の選択と解離のメソッドを含むタンデム質量分析法の原則を紹介します。また生化学的化合物を分析するための一般的な手順で使用しているタンデム質量分析法による衝突誘起解離。アプリケーションでは、監視、タンパク質翻訳後修飾の定量およびタクロリムス血中濃度の検出選択反応を説明します。

タンデム質量分析のリンクが最初に質量分析の複数の段階、生体分子を分離、化学構造の側面を確認して一緒に。生体は、その分子の組成を決定し難い大規模で複雑な構造を持ちます。タンデム質量分析は、後で識別・ シーケンスを明らかに助けることができる複数のサブユニットに断片化している興味の分子を選択します。このビデオでは、生化学のタンデム質量分析法の概念、一般的な手順とその利用方法のいくつかが表示されます。

典型的な仕様質量計測器としてタンデム質量分析を開始: イオン源、イオン、および質量分析器にサンプルを変換するとイオンの質量電荷比に基づいて分離します。他は装置の棒に衝突しながら、共通の質量分析器、四重極は、特定の割合でイオンをのみ使用できます。認められれば、種前駆イオンと呼ばれる興味の生体分子であります。イオンに衝突セル、通常別の四重極、フラグメントを予測可能なパターンでイオンにエネルギーを適用する場所に移動します。

これらのフラグメントは、飛行時間型のこれら「プロダクト イオンを分けるなど、別の質量分析器に移動します。製品イオン、通常 MS の器械のように、検出器に送られます。未知の蛋白質の場合は、結果として得られるスペクトルには生体の決定的な完全なシーケンスを生成困難多数の重複フラグメントが含まれています。しかし、スペクトルのパターンは、特定の蛋白質に一意です。解析ソフトウェアは、重複フラグメントから未知の蛋白質を解明、知られているペプチド配列のデータベースへのスペクトルを比較します。

サンプルと断片化の所望の程度に応じて複数の断片化方式が可能です。断片化のパターンは、エネルギーを転送する方法、その量と前駆イオンを配布する方法に依存します。エネルギーは、中性粒子や放射線、電子を介して転送することができます。主にそれらの識別に最適なアミノ酸間のペプチド結合の切断中性原子、衝突誘起解離または CID と呼ばれるプロセスを使用しています。

今では技術の基礎をカバーしている、細菌の細胞の封筒のコンポーネントを研究に使用されている CID タンデム質量分析法を見てみましょう。

すべての質量分析実験と同様、最初の手順は、サンプルをイオン化するためです。生体分子、マトリックス支援レーザー脱離エレクトロ スプレー イオン化とこれは通常です。前駆物質イオン信号は、イオン光学系のチューニングによって、最適化されます。ターゲットが分離されれば、および断片化メソッドを選択すると、CID など。

衝突のセルに前駆イオンを加速する、電圧印加の強さは、断片化の程度を影響します。前駆体がほぼ最高製品イオンと比較して 10% 豊富になるまで、この電圧が増加します。複数スペクトルが取得され、十分な信号対雑音比を達成するまでの平均します。必要スキャン数は元の前駆イオンの信号強度に依存して、3 から 300 までの範囲をすることができます。

この例では、エシェリヒア属大腸菌 K-12 から脂質 A の検体は、CID 後 19 主なフラグメントを持っていた。リピド A の構造はよく知られている、サンプルから特定の構成を再構築するためのソフトウェアを許可します。

今では手順を見てきた、いくつかの生化学のタンデム質量分析法を使用する方法を見てみましょう。

タンデム質量分析法における一般的なスキャン モードは選択した反応の監視、または SRM です。SRM では、両方の質量分析装置は、前駆体および製品、特定のイオンに焦点を当て、選択した質量電荷比に固定されます。SRM の感度の高いのためペプチド濃度既知の標準スペクトルを利用し、定量化する興味の蛋白質をできるように、未知のサンプルを比較できます。、

タンパク質一般官能基のメチル基、リン酸基、糖鎖と呼ばれる糖などの添加により通常翻訳後変更されます。これらは細胞シグナリング プロセス、細胞が互いに通信する方法の解明に重要です。タンデム質量分析法より小さいコンポーネントに蛋白質をフラグメント化、ため特定のフラグメントまたはアミノ酸も PTM の位置を特定することが可能です。アセチル化とトリメチルなどのいくつかの変更は、クロマト グラフ分離は、質量分析の前に行われるだけで、質量を区別することは困難。

患者の血液で多くの検体は、典型的な質量分析法の検出限界以下の濃度で発見されます。SRM の別の利点は、すべてが 1 つの製品のイオン、感度、検出下限値を最大 100 倍に強化を破棄です。この例では、タクロリムス、免疫抑制薬は、1 ng/mL のレベルで検出できます。

タンデム質量分析法でゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ計測器の理論を説明した、一般的な手順行き、手法が現在使用されている方法のいくつかを説明しました。見てくれてありがとう!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. タンデム質量分析法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications