Spectrometry total en tándem

Biochemistry

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Summary

En spectrometry total en tándem biomoléculas de interés es aislada de una muestra biológica y luego se fragmentó en múltiples subunidades con el fin de ayudar a elucidar su composición y secuencia. Esto se logra con espectrómetros de masas en serie. El primer espectrómetro ioniza una muestra y el filtro de iones de una masa específica para cargar cociente. Filtrado iones entonces son fragmentados y pasa a un segundo espectrómetro de masas donde se analizan los fragmentos.

Este video presenta los principios de la espectrometría total en tándem, incluyendo métodos de selección y disociación de ratio de masa. También se muestra es un procedimiento general para el análisis de un compuesto bioquímico usando spectrometry total en tándem con la disociación colisión-inducida. La sección de aplicaciones cubre reacción selección supervisión, determinación de las modificaciones post traducción en proteína y la detección de los niveles de tacrolimus en sangre.

Enlaces de espectrometría de masas tándem juntos múltiples etapas de espectrometría de masas primero aislar una biomolécula y luego determinan los aspectos de su composición química. Biomoléculas tienen estructuras grandes y complejas, lo que hace difícil determinar su composición molecular. Espectrometría de masas tándem selecciona una molécula de interés que más tarde se fragmentó en múltiples subunidades, que pueden ayudar a elucidar su identificación y secuencia. Este video le mostrará los conceptos de la espectrometría total en tándem, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.

Espectrometría de masas tándem comienza como un típico instrumento masa Especificaciones: con una fuente de iones, que convierte la muestra en iones y un analizador de masas, que separa los iones basados en su relación masa / carga. Un analizador de masa común, el cuadrupolo, sólo permite los iones con una relación específica, mientras que los otros crash en las barras del aparato. Las especies permitidas, llamado ion del precursor, es las biomoléculas de interés. El ion se mueve en una celda de colisión, por lo general otro quadrupole, donde energía se aplica a los iones en un patrón predecible.

Estos fragmentos se trasladan a otro analizador de la masa, como un tiempo de vuelo, que separa a estos "iones del producto". Los iones producto son enviados al detector, como un instrumento MS normal. En el caso de una proteína desconocida, el espectro resultante contiene numerosos fragmentos solapados, haciendo difícil generar una secuencia completa definitiva de las biomoléculas. Sin embargo, el patrón espectral es único para una determinada proteína. Software de análisis compara el espectro a una base de datos de secuencias de péptidos conocidos, elucidar la proteína desconocida de los fragmentos solapados.

Dependiendo de la muestra y el grado deseado de fragmentación, varios métodos de fragmentación son posibles. Patrones de fragmentación dependen de cómo la energía se transfiere, su cantidad, y cómo se distribuye a través del ion precursor. Energía puede transferirse por medio de radiación y partículas neutras y electrones. Sobre todo utilizando átomos neutrales, un proceso llamado disociación colisión-inducida o CID, hiende en el enlace peptídico entre los aminoácidos, ideales para su identificación.

Ahora que se han cubierto los fundamentos de la técnica, echemos un vistazo a spectrometry total en tándem CID siendo utilizado para el estudio de un componente de los sobres de la célula bacteriana.

Como con todos los experimentos espectrometría de masa, el primer paso es ionizar la muestra. Para biomoléculas, esto normalmente se hace con desorción láser de matriz asistida o de ionización por electrospray. La señal de ion precursor entonces se optimiza mediante la regulación de la óptica del ion. Una vez hecho esto, el objetivo es aislado y se elige el método de fragmentación, como el CID.

La fuerza de un voltaje aplicado, que acelera el ion precursor en la celda de colisión, afecta el grado de fragmentación. Esta tensión se incrementa hasta que el precursor es aproximadamente 10% abundancia en comparación con el ion de producto más alto. Múltiples espectros son adquiridos y promedio hasta que se logra una relación señal a ruido suficiente. El número de exploraciones es necesitada depende de la intensidad de la señal del ión precursor original y puede variar de 3 a 300.

Analito en este ejemplo, el lípido A de Escherichia coli K-12, tenía 19 fragmentos principales después del CID. Estructura general de lípido s es bien conocida, que software reconstruir la composición específica de la muestra.

Ahora que hemos mirado el procedimiento, Veamos algunas de las maneras de espectrometría de masas tándem es utilizado en bioquímica.

Un modo común de la exploración en espectrometría de masas tándem es reacción seleccionada supervisión o SRM. En SRM, ambos analizadores de masas están fijados a una relación de masa de la carga seleccionada, centrándose en los iones precursores y productos específicos. Debido a alto grado de sensibilidad de SRM, los espectros de niveles de péptido de concentración conocida pueden ser utilizados y comparada con la de las muestras desconocidas, permitiendo que las proteínas de interés para ser cuantificada.

Las proteínas son modificadas comúnmente después de traducción, normalmente mediante la adición de grupos funcionales como los grupos metilo, grupos fosfato y azúcares, conocidos como glycans. Estos son importantes en procesos de señalización de células elucidar cómo las células se comunican uno con el otro. Como espectrometría de masas tándem fragmentos de las proteínas en componentes más pequeños, es posible determinar la ubicación de la PTM el fragmento específico o incluso un aminoácido. Algunas modificaciones, como la acetilación y trimetilación, son difíciles de distinguir por la masa sola, para que la separación cromatográfica se realiza antes de la espectrometría de masas.

Muchos analitos en sangre del paciente se encuentran en concentraciones por debajo del límite de detección por espectrometría de masas típico. Otra ventaja de SRM es que Descartes todos sino un ion del producto, aumentar la sensibilidad y mejorar el límite de detección inferior en hasta 100 veces. En este ejemplo, el fármaco inmunosupresor tacrolimus, pudo detectarse a nivel de 1 ng/mL.

Sólo has visto video de Zeus en spectrometry total en tándem. Este video describe la teoría del instrumento, fue un procedimiento general y explicó algunas de las maneras que la técnica está siendo utilizada actualmente. ¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Spectrometry total en tándem. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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