Spectrométrie de masse MALDI-TOF

Biochemistry

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Summary

Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est une source d’ions de spectrométrie de masse idéale pour l’analyse de biomolécules. Au lieu de rayonnements ionisants composés à l’état gazeux, les échantillons sont noyées dans une matrice, qui est frappée par un laser. La matrice absorbe la majorité de l’énergie ; une partie de cette énergie est ensuite transférée à l’échantillon qui s’ionise en conséquence. Les ions échantillon peuvent ensuite être identifiées à l’aide d’un analyseur de temps de vol (TOF).

Cette vidéo couvre les principes de MALDI-TOF, notamment la sélection de la matrice et comment la TOF est utilisée pour élucider les rapports masse sur charge. Cette procédure montre la préparation d’une plaque MALDI, le chargement d’échantillons sur la plaque et le fonctionnement du spectromètre de masse TOF. Dans la dernière section, variations et applications apparaissent, y compris l’analyse de cellules entières, de la caractérisation des échantillons biologiques complexes et ionisation de pulvérisation électronique.

Désorption-ionisation laser assistée par matrice MALDI, est une source d’ions de spectrométrie de masse idéale pour l’analyse de biomolécules. La plupart des sources d’ions supprimer information structurale de biomolécules grande, fragile. MALDI maintient l’intégrité structurale et par conséquent les informations, tout en accélérant les molécules dans l’analyseur de masse, qui sépare les composés basés sur la taille et de la charge. Le plus souvent couplée avec la MALDI est le temps de vol, ou TOF, analyseur de masse. Cette vidéo va expliquer les concepts de MALDI ionisation, une procédure générale et certaines de ses utilisations en biochimie.

Pour la spectrométrie de masse à fonction, molécules doivent être ionisés dans l’état gazeux. MALDI, l’échantillon est noyée dans une matrice, typiquement un organique composé contenant aromatiques et conjugués doubles liaisons.

Quand une impulsion laser frappe ce mélange la matrice absorbe la majorité de l’énergie, rapidement s’échauffe et est désorbé ou libéré, de la surface. La matrice sous tension transfère une partie de son énergie aux biomolécules, désorption et puis ionisant eux.

MALDI est généralement associé à une heure de vol, ou TOF, analyseur de masse. Un champ électrique s’applique à l’énergie cinétique aux ions, plaçant dans une région sans champ appelée un tube de dérive. La vitesse des ions qui se déplacent dans le tube est liée à leur rapport masse-à-charge, donc les particules les plus lourdes se déplacent plus lentement à travers l’instrument. Un détecteur à l’extrémité du tube de mesure le temps de vol de chaque ion. Avec ces connaissances, ainsi que la longueur du tube et la force de champ appliqué, le ratio de la masse de charge de chaque ion peut être élucidé.

Cette parcelle d’intensité du signal à la masse-à-charge-ratio, connu comme un spectre de masse, peut être comparé à une bibliothèque de spectres collectés. Si aucune correspondance n’est trouvée, il peut les molécules peuvent être identifiés par les autres techniques, comme la spectrométrie de masse. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur le sujet.

Maintenant que nous ayons discutés les rudiments de MALDI-TOF, examinons le processus en laboratoire.

Avant de commencer une expérience, il est important de considérer le choix de la matrice, d'où les échantillons seront être désorbées. Il doit absorber l’énergie du laser, être stable dans le vide, pas réagissent avec les molécules de cible et pouvoir se désorber. Selon l’échantillon, les différentes matrices sont préférés. Pour une grosse protéine, une combinaison de CHCA et DHB a montré la meilleure séparation des pics, appelé résolution, que les matrices individuels.

Il y a un certain nombre de façons de préparer les échantillons. Nous allons montrer ce que l'on appelle le « double couche », ou « ", » méthode sandwich". Pour commencer, nettoyez la plaque MALDI avec réactifs ultra pures, comme la spectrométrie de masse est très sensible à la contamination. Sécher la plaque avec un courant de gaz inerte.

Ensuite, une solution saturée de matrice est faite, généralement avec un solvant organique. La solution est striée sur le plat de MALDI et séchée. Une deuxième solution saturée de matrice contenant l’acide trifluoroacétique ou TFA, est établie. TFA aide des ions en phase gazeuse.

Ensuite, la solution de l’échantillon est ajoutée sur le dessus de la tache séché matrice. Ajouter la solution de matrice contenant des AGT sur le dessus de l’échantillon, complétant ainsi la matrice « sandwich ». Homogénéité de la tache peut être vérifiée sous un microscope à faible puissance.

Plaque d’un étalon, qui est un mélange avec une large gamme de masses connues et sert à établir une corrélation entre le temps de vol à m/z. Enfin, la plaque la matrice seule comme témoin négatif.

Pour analyser les taches, placer la plaque de la cible dans l’instrument. S’assurer il n’y a aucun débris présents, permettant la formation d’un vide serré. Dans le logiciel, sélectionnez le contrôle standard, négatif et des échantillons d’intérêt. Les taches avec l’identification correcte de l’étiquette.

Les tensions de source et l’objectif d’ions peuvent être manipulées pour améliorer les performances de l’analyse. Cela dépendra de la spécificité de l’instrument et l’échantillon. Mettre l’accent sur l’endroit standard et calibrer l’appareil avec le logiciel.

Ensuite, recueillir des spectres de chacune des taches échantillon. Essayez quelques endroits différents sur le terrain pour optimiser la qualité des données recueillies. Une fois terminé, la plaque MALDI peut être collectée et réutilisée après le nettoyage.

Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, nous allons étudier quelques-unes des façons que MALDI est utilisée et une technique d’ionisation différents.

En plus des biomolécules, MALDI peut être utilisé pour analyser des cellules vivantes. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui prennent l’une de plusieurs formes différentes, issus de leur microenvironnement. Après avoir exposé les cellules à divers signalisation des molécules, ou cytokines, ils peuvent être ajoutés directement à la plaque et analysés. Les spectres MALDI peuvent être utilisés comme uniques « empreintes », selon la cytokine utilisé.

Des échantillons biologiques complexes comme les sécrétions sébacées mammifères nécessitent une étape de purification avant l’analyse par MALDI. Chromatographie sur couche mince est une telle technique qui repose sur la polarité des composants. Les composés sont prélevés dans le pâté de TLC, purifiées et transférés vers une matrice MALDI. Les spectres qui en résulte vérifier l’identité et la pureté de la biomolécules séparées de la sécrétion sébacée chez les mammifères.

Une autre source d’ions communs pour les biomolécules est ionisation par électronébulisation ou ESI. Dans cette méthode, l’échantillon est injecté dans l’instrument, où une tension élevée est appliquée, créant un aérosol de gouttelettes chargées. Lorsque le solvant dans la goutte s’évapore, la charge est déplacée vers les molécules de l’échantillon, jusqu'à ce qu’ils sont complètement gazeux. ESI ne nécessite pas la procédure de repérage, et l’échantillon peut être injecté directement dans l’instrument. En revanche, ESI est plus sensible à la présence de composants de tampons et d’autres contaminants, ce qui signifie la que MALDI est plus robuste.

Vous avez juste regardé les vidéo de Jupiter à la spectrométrie de masse MALDI. Cette vidéo décrit la théorie derrière l’instrument, est allé sur une procédure générale et recouvert certaines des utilisations de la technique. Merci de regarder !

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L'essentiel de la biochimie. Spectrométrie de masse MALDI-TOF. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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