Overview
יינון פירוק לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) הוא מקור יונים ספקטרומטרי מסה אידיאלי לניתוח של biomolecules. במקום לייצב תרכובות במצב הגזי, דגימות מוטבעות במטריצה, אשר נפגע על ידי לייזר. המטריצה סופגת את רוב האנרגיה; חלק מאנרגיה זו מועברת לאחר מכן לדגימה, אשר מייננות כתוצאה מכך. לאחר מכן ניתן לזהות יונים לדוגמה באמצעות מנתח זמן טיסה (TOF).
וידאו זה מכסה עקרונות של MALDI-TOF, כולל בחירת מטריצה וכיצד נעשה שימוש ב- TOF כדי לתפר את יחסי המסה לטעינה. הליך זה מראה את הכנת צלחת MALDI, טעינת דגימות על הצלחת, ואת הפעולה של ספקטרומטר מסת TOF. בחלק האחרון מוצגים יישומים וריאציות, כולל ניתוח תאים שלמים, אפיון של דגימות ביולוגיות מורכבות ויינון תרסיס אלקטרונים.
יינון פירוק לייזר בסיוע מטריקס, או MALDI, הוא מקור יון ספקטרומטרי מסה אידיאלי לניתוח של biomolecules. רוב מקורות היונים מסירים מידע מבני מביומולקולים גדולים ושבריריים. MALDI שומר על שלמות מבנית, ולכן מידע, תוך האצת המולקולות לתוך מנתח המסה, אשר מפריד את התרכובות בהתבסס על גודל ומטען. הנפוץ ביותר בשילוב עם MALDI הוא זמן הטיסה, או TOF, מנתח מסה. וידאו זה יציג את המושגים של יינון MALDI, הליך כללי, וחלק מהשימושים שלה בביוכימיה.
כדי שספקטרומטריית המסה תתפקד, יש ליינן מולקולות למצב הגזי. ב- MALDI, המדגם מוטבע במטריצה, בדרך כלל תרכובת אורגנית המכילה קשרים כפולים ארומטיים וצומדים.
כאשר פעימת לייזר פוגעת בתערובת זו המטריצה סופגת את רוב האנרגיה, מתחממת במהירות, והיא אינה משתחררת, או משוחררת, מפני השטח. המטריצה האנרגטית מעבירה חלק מהאנרגיה שלה לביומולקולים, מבטלת את ההסרה ואז מייננת אותם.
MALDI הוא בדרך כלל מזווג עם זמן טיסה, או TOF, מנתח מסה. שדה חשמלי מחיל אנרגיה קינטית על היונים, ומעביר אותם לאזור נטול שדות הנקרא צינור סחף. מהירות היונים כשהם נעים דרך הצינור קשורה ליחס המסה-לטעינה שלהם, כך שחלקיקים כבדים יותר נעים לאט יותר דרך המכשיר. גלאי בסוף הצינור מודד את זמן הטיסה של כל יון. עם ידע זה, כמו גם את אורך הצינור ואת כוח השדה מיושם, יחס מסה לטעינה של כל יון ניתן לברוח.
ניתן להשוות חלקה זו של עוצמת האות ליחס מסה-טעינה, המכונה ספקטרום מסה, לספרייה של ספקטרום שנאסף. אם לא נמצאו התאמות, ניתן לזהות מולקולות בטכניקות נוספות, כגון ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. לקבלת מידע נוסף, עיין בסרטון הווידאו של אוסף זה בנושא.
עכשיו שהיסודות של MALDI-TOF נדונו, בואו נסתכל על התהליך במעבדה.
לפני תחילת ניסוי, חשוב לשקול את הבחירה של מטריצה שממנה דגימות יהיה desorbed. הוא חייב לספוג את אנרגיית הלייזר, להיות יציב בחלל ריק, לא להגיב עם מולקולות המטרה, ולהיות מסוגל desorb. בהתאם לדגימה, מטריצות שונות עדיפות. עבור חלבון גדול, שילוב של CHCA ו- DHB הראה הפרדה טובה יותר של הפסגות, הנקראות רזולוציה, מאשר מטריצות בודדות.
ישנן מספר דרכים להכין דגימות. נראה מה שמכונה שיטת "שכבה כפולה", או "כריך". בתור התחלה, לנקות את צלחת MALDI עם ריאגנטים טהורים במיוחד, כמו ספקטרומטריית מסה רגישה מאוד לזיהום. ייבשו את הצלחת עם זרם של גז אינרטי.
לאחר מכן, פתרון מטריצה רוויה נעשה, בדרך כלל עם ממס אורגני . הפתרון מפוספס על צלחת MALDI מיובש. פתרון רווי שני של מטריצה המכילה חומצה טריפלואורואצטית, או TFA, מוכן. TFA עוזר יונים לתוך השלב הגזי.
לאחר מכן, הפתרון לדוגמה מתווסף על גבי נקודת המטריצה היבשה. הוסף את פתרון מטריצה המכיל TFA על גבי המדגם, ובכך להשלים את מטריצה "כריך". הומוגניות של המקום ניתן לאמת תחת מיקרוסקופ בעל עוצמה נמוכה.
צלחת תקן כיול, שהוא תערובת עם מגוון רחב של מסות ידועות ומשמש כדי לתאם את זמן הטיסה כדי m / z. לבסוף, צלחת המטריצה לבד כשליטה שלילית.
כדי לנתח את הנקודות, הנח את לוחית המטרה לתוך המכשיר. ודא שאין פסולת נוכחת, המאפשר היווצרות של ואקום הדוק. בתוכנה, בחר את הפקד הסטנדרטי, השלילי ודוגמאות העניין. סמן את הכתמים בזיהוי הנכון.
ניתן לתמרן את מקור היונים ואת מתחי העדשה כדי לשפר את ביצועי הניתוח. זה יהיה תלוי בפרטי המכשיר והדגימה. התמקד בנקודה הסטנדרטית וכייל את המכשיר עם התוכנה.
לאחר מכן, לאסוף ספקטרום מכל אחד מנקודות המדגם. נסה כמה מיקומים שונים במקום כדי למקסם את איכות הנתונים שנאספו. לאחר סיום, צלחת MALDI ניתן לאסוף וייעשה שימוש חוזר לאחר ניקוי.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן MALDI מנוצל, וטכניקת יינון שונה.
בנוסף biomolecules, MALDI יכול לשמש כדי לנתח תאים חיים. מקרופאגים הם תאי מערכת החיסון שלוקחים על באחת מכמה צורות שונות, בהתבסס על המיקרו-סביבה שלהם. לאחר חשיפת התאים למולקולות איתות שונות, או ציטוקינים, ניתן להוסיף להם ישירות לצלחת, ולנתח. ספקטרום MALDI יכול לשמש ייחודי "טביעות אצבע", בהתאם ציטוקינים בשימוש.
דגימות ביולוגיות מורכבות כמו הפרשות חלביות של יונקים דורשות שלב של טיהור לפני ניתוח MALDI. כרומטוגרפיה של שכבה דקה היא טכניקה אחת כזו הנשענת על הקוטביות של הרכיבים. התרכובות נאספות מפטה TLC, מטוהרות ומועברות למטריקס MALDI. הספקטרום המתקבל מאמת את זהותם וטוהרם של הביו-מולולקולים המופרדים מהפרשות החלב של היונקים.
מקור יוני נפוץ נוסף לביומולקולס הוא יינון אלקטרוספרי, או ESI. בשיטה זו, המדגם מוזרק לתוך המכשיר, שבו מתח גבוה מוחל, יצירת תרסיס של טיפות טעונות. כאשר הממס בטיפות מתאדה, המטען מועבר למולקולות המדגם, עד שהן גזיות לחלוטין. ESI אינו דורש את הליך התצפית, ואת המדגם ניתן להזריק ישירות לתוך המכשיר. מצד שני, ESI רגיש יותר לנוכחות של רכיבי חוצץ ומזהמים אחרים, כלומר MALDI הוא חזק יותר.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ספקטרומטריית מסה של מאלדי. וידאו זה תיאר את התיאוריה שמאחורי המכשיר, עבר על הליך כללי וכיסה חלק מהשימושים בטכניקה. תודה שצפיתם!
Procedure
יינון פירוק לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) הוא מקור יונים ספקטרומטרי מסה אידיאלי לניתוח של biomolecules. במקום לייצב תרכובות במצב הגזי, דגימות מוטבעות במטריצה, אשר נפגע על ידי לייזר. המטריצה סופגת את רוב האנרגיה; חלק מאנרגיה זו מועברת לאחר מכן לדגימה, אשר מייננות כתוצאה מכך. לאחר מכן ניתן לזהות יונים לדוגמה באמצעות מנתח זמן טיסה (TOF).
וידאו זה מכסה עקרונות של MALDI-TOF, כולל בחירת מטריצה וכיצד נעשה שימוש ב- TOF כדי לתפר את יחסי המסה לטעינה. הליך זה מראה את הכנת צלחת MALDI, טעינת דגימות על הצלחת, ואת הפעולה של ספקטרומטר מסת TOF. בחלק האחרון מוצגים יישומים וריאציות, כולל ניתוח תאים שלמים, אפיון של דגימות ביולוגיות מורכבות ויינון תרסיס אלקטרונים.
יינון פירוק לייזר בסיוע מטריקס, או MALDI, הוא מקור יון ספקטרומטרי מסה אידיאלי לניתוח של biomolecules. רוב מקורות היונים מסירים מידע מבני מביומולקולים גדולים ושבריריים. MALDI שומר על שלמות מבנית, ולכן מידע, תוך האצת המולקולות לתוך מנתח המסה, אשר מפריד את התרכובות בהתבסס על גודל ומטען. הנפוץ ביותר בשילוב עם MALDI הוא זמן הטיסה, או TOF, מנתח מסה. וידאו זה יציג את המושגים של יינון MALDI, הליך כללי, וחלק מהשימושים שלה בביוכימיה.
כדי שספקטרומטריית המסה תתפקד, יש ליינן מולקולות למצב הגזי. ב- MALDI, המדגם מוטבע במטריצה, בדרך כלל תרכובת אורגנית המכילה קשרים כפולים ארומטיים וצומדים.
כאשר פעימת לייזר פוגעת בתערובת זו המטריצה סופגת את רוב האנרגיה, מתחממת במהירות, והיא אינה משתחררת, או משוחררת, מפני השטח. המטריצה האנרגטית מעבירה חלק מהאנרגיה שלה לביומולקולים, מבטלת את ההסרה ואז מייננת אותם.
MALDI הוא בדרך כלל מזווג עם זמן טיסה, או TOF, מנתח מסה. שדה חשמלי מחיל אנרגיה קינטית על היונים, ומעביר אותם לאזור נטול שדות הנקרא צינור סחף. מהירות היונים כשהם נעים דרך הצינור קשורה ליחס המסה-לטעינה שלהם, כך שחלקיקים כבדים יותר נעים לאט יותר דרך המכשיר. גלאי בסוף הצינור מודד את זמן הטיסה של כל יון. עם ידע זה, כמו גם את אורך הצינור ואת כוח השדה מיושם, יחס מסה לטעינה של כל יון ניתן לברוח.
ניתן להשוות חלקה זו של עוצמת האות ליחס מסה-טעינה, המכונה ספקטרום מסה, לספרייה של ספקטרום שנאסף. אם לא נמצאו התאמות, ניתן לזהות מולקולות בטכניקות נוספות, כגון ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. לקבלת מידע נוסף, עיין בסרטון הווידאו של אוסף זה בנושא.
עכשיו שהיסודות של MALDI-TOF נדונו, בואו נסתכל על התהליך במעבדה.
לפני תחילת ניסוי, חשוב לשקול את הבחירה של מטריצה שממנה דגימות יהיה desorbed. הוא חייב לספוג את אנרגיית הלייזר, להיות יציב בחלל ריק, לא להגיב עם מולקולות המטרה, ולהיות מסוגל desorb. בהתאם לדגימה, מטריצות שונות עדיפות. עבור חלבון גדול, שילוב של CHCA ו- DHB הראה הפרדה טובה יותר של הפסגות, הנקראות רזולוציה, מאשר מטריצות בודדות.
ישנן מספר דרכים להכין דגימות. נראה מה שמכונה שיטת "שכבה כפולה", או "כריך". בתור התחלה, לנקות את צלחת MALDI עם ריאגנטים טהורים במיוחד, כמו ספקטרומטריית מסה רגישה מאוד לזיהום. ייבשו את הצלחת עם זרם של גז אינרטי.
לאחר מכן, פתרון מטריצה רוויה נעשה, בדרך כלל עם ממס אורגני . הפתרון מפוספס על צלחת MALDI מיובש. פתרון רווי שני של מטריצה המכילה חומצה טריפלואורואצטית, או TFA, מוכן. TFA עוזר יונים לתוך השלב הגזי.
לאחר מכן, הפתרון לדוגמה מתווסף על גבי נקודת המטריצה היבשה. הוסף את פתרון מטריצה המכיל TFA על גבי המדגם, ובכך להשלים את מטריצה "כריך". הומוגניות של המקום ניתן לאמת תחת מיקרוסקופ בעל עוצמה נמוכה.
צלחת תקן כיול, שהוא תערובת עם מגוון רחב של מסות ידועות ומשמש כדי לתאם את זמן הטיסה כדי m / z. לבסוף, צלחת המטריצה לבד כשליטה שלילית.
כדי לנתח את הנקודות, הנח את לוחית המטרה לתוך המכשיר. ודא שאין פסולת נוכחת, המאפשר היווצרות של ואקום הדוק. בתוכנה, בחר את הפקד הסטנדרטי, השלילי ודוגמאות העניין. סמן את הכתמים בזיהוי הנכון.
ניתן לתמרן את מקור היונים ואת מתחי העדשה כדי לשפר את ביצועי הניתוח. זה יהיה תלוי בפרטי המכשיר והדגימה. התמקד בנקודה הסטנדרטית וכייל את המכשיר עם התוכנה.
לאחר מכן, לאסוף ספקטרום מכל אחד מנקודות המדגם. נסה כמה מיקומים שונים במקום כדי למקסם את איכות הנתונים שנאספו. לאחר סיום, צלחת MALDI ניתן לאסוף וייעשה שימוש חוזר לאחר ניקוי.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן MALDI מנוצל, וטכניקת יינון שונה.
בנוסף biomolecules, MALDI יכול לשמש כדי לנתח תאים חיים. מקרופאגים הם תאי מערכת החיסון שלוקחים על באחת מכמה צורות שונות, בהתבסס על המיקרו-סביבה שלהם. לאחר חשיפת התאים למולקולות איתות שונות, או ציטוקינים, ניתן להוסיף להם ישירות לצלחת, ולנתח. ספקטרום MALDI יכול לשמש ייחודי "טביעות אצבע", בהתאם ציטוקינים בשימוש.
דגימות ביולוגיות מורכבות כמו הפרשות חלביות של יונקים דורשות שלב של טיהור לפני ניתוח MALDI. כרומטוגרפיה של שכבה דקה היא טכניקה אחת כזו הנשענת על הקוטביות של הרכיבים. התרכובות נאספות מפטה TLC, מטוהרות ומועברות למטריקס MALDI. הספקטרום המתקבל מאמת את זהותם וטוהרם של הביו-מולולקולים המופרדים מהפרשות החלב של היונקים.
מקור יוני נפוץ נוסף לביומולקולס הוא יינון אלקטרוספרי, או ESI. בשיטה זו, המדגם מוזרק לתוך המכשיר, שבו מתח גבוה מוחל, יצירת תרסיס של טיפות טעונות. כאשר הממס בטיפות מתאדה, המטען מועבר למולקולות המדגם, עד שהן גזיות לחלוטין. ESI אינו דורש את הליך התצפית, ואת המדגם ניתן להזריק ישירות לתוך המכשיר. מצד שני, ESI רגיש יותר לנוכחות של רכיבי חוצץ ומזהמים אחרים, כלומר MALDI הוא חזק יותר.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ספקטרומטריית מסה של מאלדי. וידאו זה תיאר את התיאוריה שמאחורי המכשיר, עבר על הליך כללי וכיסה חלק מהשימושים בטכניקה. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
