Overview
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. Em vez de compostos ionizantes no estado gasoso, as amostras são incorporadas em uma matriz, que é atingida por um laser. A matriz absorve a maior parte da energia; parte dessa energia é então transferida para a amostra, que ioniza como resultado. Os íons de amostra podem então ser identificados usando um analisador de tempo de voo (TOF).
Este vídeo abrange princípios do MALDI-TOF, incluindo a seleção de matrizes e como o TOF é usado para elucidar as relações massa-carga. Este procedimento mostra a preparação de uma placa MALDI, o carregamento de amostras na placa e o funcionamento do espectrômetro de massa TOF. Na seção final, são mostradas aplicações e variações, incluindo análise de células inteiras, caracterização de amostras biológicas complexas e ionização de spray de elétrons.
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz, ou MALDI, é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. A maioria das fontes de íons remove informações estruturais de grandes e frágeis biomoléculas. O MALDI mantém a integridade estrutural e, portanto, a informação, acelerando as moléculas no analisador de massa, que separa os compostos com base no tamanho e na carga. O mais comumente acoplado com MALDI é o tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Este vídeo mostrará os conceitos de ionização maldi, um procedimento geral e alguns de seus usos na bioquímica.
Para que a espectrometria de massa funcione, as moléculas devem ser ionizadas para o estado gasoso. No MALDI, a amostra é incorporada em uma matriz, tipicamente um composto orgânico contendo ligações duplas aromáticas e conjugadas.
Quando um pulso de laser atinge essa mistura, a matriz absorve a maior parte da energia, aquece rapidamente, e é desordenada, ou liberada, da superfície. A matriz energizada transfere parte de sua energia para as biomoléculas, desordenando e, em seguida, ionizando-as.
Maldi é tipicamente emparelhado com um tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Um campo elétrico aplica energia cinética aos íons, movendo-os para uma região livre de campo chamada tubo de deriva. A velocidade dos íons enquanto se movem através do tubo está relacionada com sua relação massa-carga, de modo que partículas mais pesadas viajam mais lentamente através do instrumento. Um detector no final do tubo mede o tempo de voo de cada íon. Com esse conhecimento, bem como o comprimento do tubo e a força de campo aplicada, a relação massa-carga de cada íon pode ser elucidada.
Este gráfico de intensidade de sinal para a relação massa-carga, conhecido como espectro de massa, pode ser comparado a uma biblioteca de espectros coletados. Se não forem encontradas correspondências, podem ser identificadas moléculas por outras técnicas, como espectrometria de massa tandem. Para mais informações, consulte o vídeo desta coleção sobre o tema.
Agora que os fundamentos do MALDI-TOF foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
Antes de iniciar um experimento, é importante considerar a escolha da matriz de qual as amostras serão desordenadas. Ele deve absorver a energia laser, ser estável no vácuo, não reagir com as moléculas alvo, e ser capaz de desorb. Dependendo da amostra, são preferidas diferentes matrizes. Para uma proteína grande, uma combinação de CHCA e DHB tem mostrado melhor separação dos picos, chamada resolução, do que as matrizes individuais.
Há várias maneiras de preparar amostras. Vamos mostrar o que é conhecido como "dupla camada", ou "sanduíche", método. Para começar, limpe a placa MALDI com reagentes ultra-puros, pois a espectrometria de massa é muito sensível à contaminação. Seque a placa com um fluxo de gás inerte.
Em seguida, uma solução de matriz saturada é feita, tipicamente com um solvente orgânico. A solução é listrada na placa MALDI e seca. Uma segunda solução saturada de matriz contendo ácido trifluoroacético, ou TFA, é preparada. TFA ajuda íons na fase gasosa.
Em seguida, a solução amostral é adicionada em cima do ponto de matriz seca. Adicione a solução de matriz contendo TFA em cima da amostra, completando assim a matriz "sanduíche". A homogeneidade do local pode ser verificada sob um microscópio de baixa potência.
Emplaque um padrão de calibração, que é uma mistura com uma ampla gama de massas conhecidas e é usado para correlacionar o tempo de voo para m/z. Finalmente, emplaque a matriz sozinho como um controle negativo.
Para analisar as manchas, coloque a placa alvo no instrumento. Certifique-se de que não há detritos presentes, permitindo a formação de um vácuo apertado. No software, selecione o padrão, controle negativo e amostras de interesse. Rotule as manchas com a identificação correta.
A fonte de íon e as tensões das lentes podem ser manipuladas para melhorar o desempenho da análise. Isso dependerá das especificidades do instrumento e da amostra. Concentre-se no ponto padrão e calibrar o instrumento com o software.
Em seguida, colete espectros de cada um dos pontos amostrais. Experimente alguns locais diferentes no local para maximizar a qualidade dos dados coletados. Uma vez concluída, a placa MALDI pode ser coletada e reutilizada após a limpeza.
Agora que revisamos um procedimento, vamos ver algumas das maneiras como o MALDI é utilizado, e uma técnica de ionização diferente.
Além das biomoléculas, o MALDI pode ser usado para analisar células vivas. Macrófagos são células imunes que assumem uma das várias formas diferentes, com base em seu microambiente. Depois de expor as células a várias moléculas de sinalização, ou citocinas, elas podem ser adicionadas diretamente à placa, e analisadas. O espectro MALDI pode ser usado como "impressões digitais" únicas, dependendo da citocina usada.
Amostras biológicas complexas como secreções sebáceas de mamíferos requerem um passo de purificação antes da análise maldi. A cromatografia de camada fina é uma dessas técnicas que se baseia na polaridade dos componentes. Os compostos são coletados do patê TLC, purificados e transferidos para uma matriz MALDI. Os espectros resultantes verificam a identidade e pureza das biomoléculas separadas das secreções sebáceas dos mamíferos.
Outra fonte comum de íons para biomoléculas é a ionização eletrospray, ou ESI. Neste método, a amostra é injetada no instrumento, onde uma alta tensão é aplicada, criando um aerossol de gotículas carregadas. À medida que o solvente na gotícula evapora, a carga é movida para as moléculas da amostra, até que elas sejam completamente gasosas. O ESI não requer o procedimento de manchas, e a amostra pode ser injetada diretamente no instrumento. Por outro lado, o ESI é mais sensível à presença de componentes tampão e outros contaminantes, o que significa que o MALDI é mais robusto.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa MALDI. Este vídeo descreveu a teoria por trás do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e cobriu alguns dos usos da técnica. Obrigado por assistir!
Procedure
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. Em vez de compostos ionizantes no estado gasoso, as amostras são incorporadas em uma matriz, que é atingida por um laser. A matriz absorve a maior parte da energia; parte dessa energia é então transferida para a amostra, que ioniza como resultado. Os íons de amostra podem então ser identificados usando um analisador de tempo de voo (TOF).
Este vídeo abrange princípios do MALDI-TOF, incluindo a seleção de matrizes e como o TOF é usado para elucidar as relações massa-carga. Este procedimento mostra a preparação de uma placa MALDI, o carregamento de amostras na placa e o funcionamento do espectrômetro de massa TOF. Na seção final, são mostradas aplicações e variações, incluindo análise de células inteiras, caracterização de amostras biológicas complexas e ionização de spray de elétrons.
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz, ou MALDI, é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. A maioria das fontes de íons remove informações estruturais de grandes e frágeis biomoléculas. O MALDI mantém a integridade estrutural e, portanto, a informação, acelerando as moléculas no analisador de massa, que separa os compostos com base no tamanho e na carga. O mais comumente acoplado com MALDI é o tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Este vídeo mostrará os conceitos de ionização maldi, um procedimento geral e alguns de seus usos na bioquímica.
Para que a espectrometria de massa funcione, as moléculas devem ser ionizadas para o estado gasoso. No MALDI, a amostra é incorporada em uma matriz, tipicamente um composto orgânico contendo ligações duplas aromáticas e conjugadas.
Quando um pulso de laser atinge essa mistura, a matriz absorve a maior parte da energia, aquece rapidamente, e é desordenada, ou liberada, da superfície. A matriz energizada transfere parte de sua energia para as biomoléculas, desordenando e, em seguida, ionizando-as.
Maldi é tipicamente emparelhado com um tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Um campo elétrico aplica energia cinética aos íons, movendo-os para uma região livre de campo chamada tubo de deriva. A velocidade dos íons enquanto se movem através do tubo está relacionada com sua relação massa-carga, de modo que partículas mais pesadas viajam mais lentamente através do instrumento. Um detector no final do tubo mede o tempo de voo de cada íon. Com esse conhecimento, bem como o comprimento do tubo e a força de campo aplicada, a relação massa-carga de cada íon pode ser elucidada.
Este gráfico de intensidade de sinal para a relação massa-carga, conhecido como espectro de massa, pode ser comparado a uma biblioteca de espectros coletados. Se não forem encontradas correspondências, podem ser identificadas moléculas por outras técnicas, como espectrometria de massa tandem. Para mais informações, consulte o vídeo desta coleção sobre o tema.
Agora que os fundamentos do MALDI-TOF foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
Antes de iniciar um experimento, é importante considerar a escolha da matriz de qual as amostras serão desordenadas. Ele deve absorver a energia laser, ser estável no vácuo, não reagir com as moléculas alvo, e ser capaz de desorb. Dependendo da amostra, são preferidas diferentes matrizes. Para uma proteína grande, uma combinação de CHCA e DHB tem mostrado melhor separação dos picos, chamada resolução, do que as matrizes individuais.
Há várias maneiras de preparar amostras. Vamos mostrar o que é conhecido como "dupla camada", ou "sanduíche", método. Para começar, limpe a placa MALDI com reagentes ultra-puros, pois a espectrometria de massa é muito sensível à contaminação. Seque a placa com um fluxo de gás inerte.
Em seguida, uma solução de matriz saturada é feita, tipicamente com um solvente orgânico. A solução é listrada na placa MALDI e seca. Uma segunda solução saturada de matriz contendo ácido trifluoroacético, ou TFA, é preparada. TFA ajuda íons na fase gasosa.
Em seguida, a solução amostral é adicionada em cima do ponto de matriz seca. Adicione a solução de matriz contendo TFA em cima da amostra, completando assim a matriz "sanduíche". A homogeneidade do local pode ser verificada sob um microscópio de baixa potência.
Emplaque um padrão de calibração, que é uma mistura com uma ampla gama de massas conhecidas e é usado para correlacionar o tempo de voo para m/z. Finalmente, emplaque a matriz sozinho como um controle negativo.
Para analisar as manchas, coloque a placa alvo no instrumento. Certifique-se de que não há detritos presentes, permitindo a formação de um vácuo apertado. No software, selecione o padrão, controle negativo e amostras de interesse. Rotule as manchas com a identificação correta.
A fonte de íon e as tensões das lentes podem ser manipuladas para melhorar o desempenho da análise. Isso dependerá das especificidades do instrumento e da amostra. Concentre-se no ponto padrão e calibrar o instrumento com o software.
Em seguida, colete espectros de cada um dos pontos amostrais. Experimente alguns locais diferentes no local para maximizar a qualidade dos dados coletados. Uma vez concluída, a placa MALDI pode ser coletada e reutilizada após a limpeza.
Agora que revisamos um procedimento, vamos ver algumas das maneiras como o MALDI é utilizado, e uma técnica de ionização diferente.
Além das biomoléculas, o MALDI pode ser usado para analisar células vivas. Macrófagos são células imunes que assumem uma das várias formas diferentes, com base em seu microambiente. Depois de expor as células a várias moléculas de sinalização, ou citocinas, elas podem ser adicionadas diretamente à placa, e analisadas. O espectro MALDI pode ser usado como "impressões digitais" únicas, dependendo da citocina usada.
Amostras biológicas complexas como secreções sebáceas de mamíferos requerem um passo de purificação antes da análise maldi. A cromatografia de camada fina é uma dessas técnicas que se baseia na polaridade dos componentes. Os compostos são coletados do patê TLC, purificados e transferidos para uma matriz MALDI. Os espectros resultantes verificam a identidade e pureza das biomoléculas separadas das secreções sebáceas dos mamíferos.
Outra fonte comum de íons para biomoléculas é a ionização eletrospray, ou ESI. Neste método, a amostra é injetada no instrumento, onde uma alta tensão é aplicada, criando um aerossol de gotículas carregadas. À medida que o solvente na gotícula evapora, a carga é movida para as moléculas da amostra, até que elas sejam completamente gasosas. O ESI não requer o procedimento de manchas, e a amostra pode ser injetada diretamente no instrumento. Por outro lado, o ESI é mais sensível à presença de componentes tampão e outros contaminantes, o que significa que o MALDI é mais robusto.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa MALDI. Este vídeo descreveu a teoria por trás do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e cobriu alguns dos usos da técnica. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
