酶活性实验及动力学

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

酶动力学描述的催化作用的酶,是促进化学反应生物体所需的生物分子。酶的作用,对分子,简称为底物,以形式的产品。通过直接或间接测量基板或产品浓度随着时间的推移变化的测定,确定酶动力学参数。

这个视频将覆盖 (包括速率方程) 的酶动力学和动力学模型的基本原则。此外讨论了关于酶测定结果的概念,其次是典型的比色法测定。应用程序部分论述了福斯特共振能量转移 (FRET) 分析,表征胞外酶活性在环境中,通过酶法和调查 DNA 修复动力学使用分子探针。

酶是生命来说是必不可少的生化催化剂。酶检测方法用于研究阐明酶的催化作用的酶促反应的动力学特性。这个视频将涉及酶动力学和化验,复习一般的程序,并显示一些应用程序.

酶是蛋白质分子作用于反应物分子,称为基底。酶降低生化反应的活化能。这允许反应发生在更快的速率,与降低能源需求。

酶促反应可以分为三个基本组件。第一是酶-底物的成因复杂,形成由基质酶活性位点的绑定。复合体可以分解成其原始的成分。这是二个基元反应。或者,复杂可以形成产品并恢复酶,第三个基元反应。

基元反应的动力学是由基本的速率法方程给出的。速率法方程给在浓度的速率常数和反应率。每个基元反应有个别速率法方程,与自己的速率常数。这些方程可以被分成称为米氏方程的动力学模型。这给出了反应速率的底物浓度;这可以通过实验确定。可以使用米氏方程确定一些酶反应的总趋势。高底物浓度达到饱和点,称为 Vmax。在这里,速率受总酶的浓度,和一种酶的底物分子数目将转换成产品每给出了时间,也称为 kcat。在米氏动力学 kcat 是控制反应速率的两个常数之一。其他常数,公里,被称为亲和常数。KM 也是相当于浓度,反应速率等于二分之一 Vmax。一种酶与较高的亲和力将有较低的 KM 和达到 Vmax 速度更快,虽然一种酶与低亲和性会有较高的 KM 和达到 Vmax 需长。了解 kcat 和 KM 允许的酶来进行比较。为此我们使用称为酶效率比率。高 kcat 和低公里导致更高的效率,同时降低 kcat 和在较低的高 KM 结果。

用来阐明酶动力学的因素必须通过实验确定。这些检测通常是由混合酶和底物溶液在受控环境中执行的。通过测量浓度的底物、 产品或副产品随时间的变化进行观察。

随着时间的推移浓度的变化用于确定反应速率。为了确定动力学,必须在多个浓度获得率数据。如果逆初始速率与逆初始浓度,称为莱恩威弗-伯克情节,情节是线性的则反应跟随米氏动力学特征。斜率和截距线允许 KM 和 Vmax,然后可以用来计算 kcat 高效酶的动力学参数测定。

现在,讨论了酶动力学的原则,让我们看看如何执行典型的酶。

在此过程中表现出比色法测定。第一步是生成的标准曲线,将关联蛋白浓度与吸光度。解决方案的已知浓度的准备和一个对照样本。添加与靶蛋白反应,开发人员解决方案,以产生一种有色的化合物。吸光度测量,密谋反对浓度来生成的标准曲线。

若要执行检测,已知底物浓度的准备加上适当的酶。酶和底物混合并允许孵育设定的时间间隔。缓冲溶液并加热块的 ph 值和温度控制。猝灭剂添加停止反应。开发人员解决方案是添加到反应,然后混合。解决方案然后放在小试管和测定吸光度。底物消耗的量是通过比较测量吸光度标准曲线确定的。使用所收集的数据,初步反应速率取决于绘制浓度随着时间的推移。最后,浓度与速率数据,米氏情节了。这允许营业额数量和酶效率等酶的动力学性能的测定。

既然我们已经回顾了检测程序,让我们看看其他进行检测的方法和他们的应用程序。

在此过程中 FRET 分析方法来研究一种蛋白酶水解蛋白质肽键的动力学。这些排放量可以被测量,允许为衬底消费和生产的连续和定量的分析,协助确定反应动力学。

酶活性实验可以在环境科学中用于确定在环境中的胞外酶活性的水平。水、 土壤和沉积物可以收集从环境和在实验室中进行处理。胞外酶的活性,这些材料的特点然后可以使用酶测定结果。这是一个有用的工具,对于理解环境如何处理有机物质。

细胞核中发现的酶动力学研究,可以评价细胞 DNA 修复机制。率的一种酶中移除 DNA 损伤或损坏,可以测定荧光分子信标,只发出荧光,当绑定到独特的 DNA 序列。DNA 修复的水平可以通过检测荧光标记的裂解产品实时测量。

你刚看了朱庇特的视频对酶动力学和检测方法。这个视频说明酶动力学、 覆盖检测概念,走过去一般的程序,并描述某些应用程序。

谢谢观赏 !

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物化学精要. 酶活性实验及动力学. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications