Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

Biochemistry

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Summary

El análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) es un procedimiento bioquímico utilizado para aclarar la unión entre proteínas y ácidos nucleicos. En este ensayo se mezclan un ácido nucleico radiomarcado y prueba de la proteína. Enlace se determina mediante electroforesis en gel que separa componentes basados en la masa, carga y conformación.

Este video muestra los conceptos de EMSA y un procedimiento general, incluyendo detección, encuadernación, electroforesis y preparación del gel y de la proteína. En este video las aplicaciones incluyen el análisis de enzimas de remodelación de la cromatina, una EMSA modificado que incorpora biontinylation y el estudio de los sitios de los reguladores de la respuesta bacteriana de Unión.

EMSA, el análisis de cambio de movilidad electroforética, también conocido como el análisis de cambio de gel, es un procedimiento bioquímico versátil y sensible. EMSA aclara unión entre proteínas y ácidos nucleicos mediante la detección de un cambio de bandas en electroforesis en gel.

Este video describe los principios de la EMSA, proporciona un procedimiento general y habla de algunas aplicaciones.

Replicación del ADN, transcripción y reparación, así como procesamiento de RNA es procesos bioquímicos todos críticos. Todos implican la unión entre proteínas y ácidos nucleicos. Muchos trastornos y enfermedades graves se asocian a modificaciones en este enlace. EMSA es una técnica para determinar cualitativamente si una proteína específica se une a un ácido nucleico específico. En primer lugar, se etiqueta el ácido nucleico, generalmente con fósforo-32 radioactivo, para crear una punta de prueba. Luego la proteína de prueba y sonda de ácido nucleico se mezclan. Cuando una proteína se une a una sonda de ácido nucleico, el complejo resultante tiene mayor masa y una conformación diferente que el ácido nucleico solo.

Una vez enlazado, los complejos se analizan con electroforesis en gel. En esta técnica, un campo eléctrico fuerza macromoléculas para migrar a través de una matriz de gel. Los componentes separan en base a masa, carga y conformación. Electroforesis puede separar complejos proteína-DNA de sondas no consolidadas. Puesto que tienen conformaciones y diferentes masas, que migran por el gel a diferentes ritmos y separar. La separación se detecta fácilmente, gracias a la presencia de fósforo radiactivo y prueba con éxito, la proteína se une al ácido nucleico determinado. Para verificar la identificación de la proteína, un "supercambio" emplea un anticuerpo con una conocida afinidad a la proteína. Esto tiene la ventaja de desplazar aún más el complejo, aumentando la resolución.

Ahora que hemos visto los principios, vamos a ver en el laboratorio.

Para comenzar el procedimiento, la proteína debe estar aislada. Para ello, se utilizan técnicas de biología molecular para expresar la proteína en las células y luego purificar.

El ácido nucleico es amplificado y etiquetado para crear una punta de prueba. Etiquetado se realiza a través de la incubación durante 10 minutos con dCTP con fósforo-32 radioactivo. Un banco de trabajo de seguridad de radiación y equipos de protección se requiere.

Luego se prepara el gel. El gel debe ser no-desnaturalizar, para evitar que la proteína alterar la conformación y potencialmente desvinculación de la sonda durante la electroforesis. Geles de poliacrilamida tienen tamaños de poro de 5 a 20 nm y son útiles para las sondas cortas hasta 100 pares de bases en longitud. Geles de agarosa tienen tamaños de poro de 70-700 nm y son útiles para las sondas más grandes.

Con la proteína y la sonda de ácido nucleico ya preparados, procedemos a atar. Se prepara una solución de tampón TRIS y se añaden la proteína y la sonda. El pH debe ser similar a las condiciones fisiológicas y concentración de la sal suficiente para impedir que la proteína formando lazos débiles con los ácidos nucleicos no objetivo. La reacción procede por 20-30 min a 4 ° C.

El siguiente paso es la electroforesis. Se utiliza un tampón de baja fuerza iónica y pH similar a la utilizada en la reacción de enlace. Produce un "efecto jaulas" que estabiliza los complejos, aumenta la movilidad y reduce la generación de calor. Después de la electroforesis, los componentes del gel se transfieren a papel de filtro. En un cuarto oscuro, el papel de filtro luego se expone a la película. Si la proteína se une a la sonda, dos regiones diferentes de etiquetado será visibles en la transferencia. Que representa el complejo y aparte una que representa la punta de prueba independiente. La separación demuestra que la proteína unida con éxito para el ácido nucleico.

Ahora que hemos visto lo básico, vamos a ver algunas aplicaciones.

La cromatina es el complejo firmemente lleno de ADN y proteínas que se encuentran las células eucariotas. Remodelación de cromatina enzimas modifican la estructura para abrir la DNA transcripción. Como esto cambia la movilidad del complejo, EMSA puede utilizarse para explorar la actividad de la enzima.

Un enfoque alternativo para etiquetado toma ventaja de la interacción entre la DNA y la enzima metiltransferasa. Un cofactor puede ser modificado para enlazar permanentemente a la DNA vía metiltransferasa. En lugar de etiquetar con fósforo-32, el cofactor es conjugado con biotina, que es ventajoso ya que no es radiactivo. Porque el cofactor es específico en su fijación, es relevante para la genotipificación y detección de metilación genes. Los biotinilated los ácidos nucleicos son detectados a través de fluorescencia ULTRAVIOLETA.

Cuando estímulos ambientales activan cinasas de la histidina, se fosforila un "regulador de respuesta". Esto a su vez se une al DNA, que afectan a la transcripción, que puede ser estudiada por EMSA. Por ejemplo, un regulador de respuesta de Desulfovibrio vulgaris fue demostrado para enlazar con el gen de interés. EMSA se utilizó para verificar que el enlace tuvo lugar.

Sólo ha visto video en lo análisis de cambio de movilidad electroforética de Zeus. Ahora debe comprender sus principios de operación, los pasos de su procedimiento y sus principales parámetros de funcionamiento.

¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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