Overview
Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione.
Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l'elettroforesi e il rilevamento. Le applicazioni trattate in questo video includono l'analisi degli enzimi rimodellanti la cromatina, un EMSA modificato che incorpora la biontinilazione e lo studio dei siti di legame dei regolatori della risposta batterica.
EMSA, il test di spostamento della mobilità elettroforetica, noto anche come test di spostamento del gel, è una procedura biochimica versatile e sensibile. EMSA chiarisce il legame tra proteine e acidi nucleici rilevando uno spostamento delle bande nell'elettroforesi su gel.
Questo video descrive i principi dell'EMSA, fornisce una procedura generale e discute alcune applicazioni.
La replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA, così come l'elaborazione dell'RNA sono tutti processi biochimici critici. Tutti coinvolgono il legame tra proteine e acidi nucleici. Molte malattie e disturbi gravi sono associati a modifiche in questo legame. L'EMSA è una tecnica per determinare qualitativamente se una proteina specifica si lega a uno specifico acido nucleico. In primo luogo, l'acido nucleico viene etichettato, di solito con fosforo-32 radioattivo, per creare una sonda. Quindi la proteina di prova e la sonda dell'acido nucleico vengono miscelate. Quando una proteina si lega a una sonda di acido nucleico, il complesso risultante ha una massa maggiore e una conformazione diversa rispetto al solo acido nucleico.
Una volta legati, i complessi vengono analizzati con elettroforesi su gel. In questa tecnica, un campo elettrico costringe le macromolecole a migrare attraverso una matrice di gel. I componenti si separano in base a massa, carica e conformazione. L'elettroforesi può separare i complessi proteina-DNA dalle sonde non legate. Poiché hanno masse e conformazioni diverse, migreranno attraverso il gel a velocità diverse e separate. La separazione è facilmente rilevabile, grazie alla presenza del fosforo radioattivo, e dimostra che la proteina si lega con successo all'acido nucleico dato. Per verificare l'identificazione della proteina, un "test supershift" utilizza un anticorpo con un'affinità nota alla proteina. Ciò ha l'ulteriore vantaggio di spostare ulteriormente la risoluzione complessa e crescente.
Ora che abbiamo visto i principi, vediamolo in laboratorio.
Per iniziare la procedura, la proteina deve essere isolata. Per fare questo, le tecniche di biologia molecolare vengono utilizzate per esprimere la proteina nelle cellule e quindi purificare.
L'acido nucleico viene amplificato ed etichettato per creare una sonda. L'etichettatura viene effettuata attraverso l'incubazione per 10 minuti con dCTP contenente fosforo-32 radioattivo. Sono necessari un banco da lavoro sicuro per le radiazioni e dispositivi di protezione.
Il gel viene quindi preparato. Il gel deve essere non denaturante, per evitare che la proteina alteri la conformazione e potenzialmente si slega dalla sonda durante l'elettroforesi. I gel di poliacrilammide hanno dimensioni dei pori da 5 a 20 nm e sono utili per sonde corte fino a 100 paia di basi di lunghezza. I gel di acarosio hanno dimensioni dei pori di 70-700 nm e sono utili per sonde più grandi.
Con la sonda proteica e dell'acido nucleico ora preparata, si procede al legame. Viene preparata una soluzione tampone TRIS e vengono aggiunte la proteina e la sonda. Il pH dovrebbe essere simile alle condizioni fisiologiche e la concentrazione di sale sufficiente per evitare che la proteina formi legami deboli con acidi nucleici non bersaglio. La reazione procede per 20-30 min a 4 °C.
Il prossimo passo è l'elettroforesi. Viene utilizzato un tampone di bassa resistenza ionica e un pH simile a quello utilizzato nella reazione di legame. Produce un "effetto intasamento" che stabilizza i complessi, aumenta la mobilità e riduce la generazione di calore. Dopo l'elettroforesi, i componenti del gel vengono trasferiti su carta da filtro. In una stanza buia, la carta da filtro viene quindi esposta alla pellicola. Se la proteina si lega alla sonda, nel trasferimento saranno visibili due distinte regioni etichettate. Uno che rappresenta il complesso e uno separato che rappresenta la sonda non legata. La separazione dimostra che la proteina si è legata con successo all'acido nucleico.
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.
La cromatina è il complesso strettamente imballato di DNA e proteine che si trovano nelle cellule eucariotiche. Gli enzimi rimodellanti la cromatina modificano la struttura per aprire il DNA alla trascrizione. Poiché questo cambia la mobilità del complesso, EMSA può essere utilizzato per esplorare l'attività di legame dell'enzima.
Un approccio alternativo all'etichettatura sfrutta l'interazione tra il DNA e l'enzima metiltransferasi. Un cofattore può essere modificato per legarsi permanentemente al DNA tramite metiltransferasi. Piuttosto che etichettare con fosforo-32, il cofattore è coniugato alla biotina, il che è vantaggioso perché non è radioattivo. Poiché il cofattore è sito-specifico nel suo attaccamento, è rilevante per la genotipizzazione, il rilevamento della metilazione e la consegna genica. Gli acidi nucleici biotinilati vengono rilevati attraverso la fluorescenza ultravioletta.
Quando gli stimoli ambientali attivano le istidina chinasi, un "regolatore di risposta" viene fosforilato. Questo a sua volta si lega al DNA, influenzando la trascrizione, che può essere studiata dall'EMSA. Ad esempio, è stato dimostrato che un regolatore di risposta in Desulfovibrio vulgaris si lega al gene di interesse. L'EMSA è stato utilizzato per verificare che il vincolo abbia avuto luogo.
Hai appena visto il video di JoVE sul test del turno di mobilità elettroforetica. Ora dovresti capire i suoi principi di funzionamento, i passaggi della sua procedura e i suoi principali parametri operativi.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione.
Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l'elettroforesi e il rilevamento. Le applicazioni trattate in questo video includono l'analisi degli enzimi rimodellanti la cromatina, un EMSA modificato che incorpora la biontinilazione e lo studio dei siti di legame dei regolatori della risposta batterica.
EMSA, il test di spostamento della mobilità elettroforetica, noto anche come test di spostamento del gel, è una procedura biochimica versatile e sensibile. EMSA chiarisce il legame tra proteine e acidi nucleici rilevando uno spostamento delle bande nell'elettroforesi su gel.
Questo video descrive i principi dell'EMSA, fornisce una procedura generale e discute alcune applicazioni.
La replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA, così come l'elaborazione dell'RNA sono tutti processi biochimici critici. Tutti coinvolgono il legame tra proteine e acidi nucleici. Molte malattie e disturbi gravi sono associati a modifiche in questo legame. L'EMSA è una tecnica per determinare qualitativamente se una proteina specifica si lega a uno specifico acido nucleico. In primo luogo, l'acido nucleico viene etichettato, di solito con fosforo-32 radioattivo, per creare una sonda. Quindi la proteina di prova e la sonda dell'acido nucleico vengono miscelate. Quando una proteina si lega a una sonda di acido nucleico, il complesso risultante ha una massa maggiore e una conformazione diversa rispetto al solo acido nucleico.
Una volta legati, i complessi vengono analizzati con elettroforesi su gel. In questa tecnica, un campo elettrico costringe le macromolecole a migrare attraverso una matrice di gel. I componenti si separano in base a massa, carica e conformazione. L'elettroforesi può separare i complessi proteina-DNA dalle sonde non legate. Poiché hanno masse e conformazioni diverse, migreranno attraverso il gel a velocità diverse e separate. La separazione è facilmente rilevabile, grazie alla presenza del fosforo radioattivo, e dimostra che la proteina si lega con successo all'acido nucleico dato. Per verificare l'identificazione della proteina, un "test supershift" utilizza un anticorpo con un'affinità nota alla proteina. Ciò ha l'ulteriore vantaggio di spostare ulteriormente la risoluzione complessa e crescente.
Ora che abbiamo visto i principi, vediamolo in laboratorio.
Per iniziare la procedura, la proteina deve essere isolata. Per fare questo, le tecniche di biologia molecolare vengono utilizzate per esprimere la proteina nelle cellule e quindi purificare.
L'acido nucleico viene amplificato ed etichettato per creare una sonda. L'etichettatura viene effettuata attraverso l'incubazione per 10 minuti con dCTP contenente fosforo-32 radioattivo. Sono necessari un banco da lavoro sicuro per le radiazioni e dispositivi di protezione.
Il gel viene quindi preparato. Il gel deve essere non denaturante, per evitare che la proteina alteri la conformazione e potenzialmente si slega dalla sonda durante l'elettroforesi. I gel di poliacrilammide hanno dimensioni dei pori da 5 a 20 nm e sono utili per sonde corte fino a 100 paia di basi di lunghezza. I gel di acarosio hanno dimensioni dei pori di 70-700 nm e sono utili per sonde più grandi.
Con la sonda proteica e dell'acido nucleico ora preparata, si procede al legame. Viene preparata una soluzione tampone TRIS e vengono aggiunte la proteina e la sonda. Il pH dovrebbe essere simile alle condizioni fisiologiche e la concentrazione di sale sufficiente per evitare che la proteina formi legami deboli con acidi nucleici non bersaglio. La reazione procede per 20-30 min a 4 °C.
Il prossimo passo è l'elettroforesi. Viene utilizzato un tampone di bassa resistenza ionica e un pH simile a quello utilizzato nella reazione di legame. Produce un "effetto intasamento" che stabilizza i complessi, aumenta la mobilità e riduce la generazione di calore. Dopo l'elettroforesi, i componenti del gel vengono trasferiti su carta da filtro. In una stanza buia, la carta da filtro viene quindi esposta alla pellicola. Se la proteina si lega alla sonda, nel trasferimento saranno visibili due distinte regioni etichettate. Uno che rappresenta il complesso e uno separato che rappresenta la sonda non legata. La separazione dimostra che la proteina si è legata con successo all'acido nucleico.
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.
La cromatina è il complesso strettamente imballato di DNA e proteine che si trovano nelle cellule eucariotiche. Gli enzimi rimodellanti la cromatina modificano la struttura per aprire il DNA alla trascrizione. Poiché questo cambia la mobilità del complesso, EMSA può essere utilizzato per esplorare l'attività di legame dell'enzima.
Un approccio alternativo all'etichettatura sfrutta l'interazione tra il DNA e l'enzima metiltransferasi. Un cofattore può essere modificato per legarsi permanentemente al DNA tramite metiltransferasi. Piuttosto che etichettare con fosforo-32, il cofattore è coniugato alla biotina, il che è vantaggioso perché non è radioattivo. Poiché il cofattore è sito-specifico nel suo attaccamento, è rilevante per la genotipizzazione, il rilevamento della metilazione e la consegna genica. Gli acidi nucleici biotinilati vengono rilevati attraverso la fluorescenza ultravioletta.
Quando gli stimoli ambientali attivano le istidina chinasi, un "regolatore di risposta" viene fosforilato. Questo a sua volta si lega al DNA, influenzando la trascrizione, che può essere studiata dall'EMSA. Ad esempio, è stato dimostrato che un regolatore di risposta in Desulfovibrio vulgaris si lega al gene di interesse. L'EMSA è stato utilizzato per verificare che il vincolo abbia avuto luogo.
Hai appena visto il video di JoVE sul test del turno di mobilità elettroforetica. Ora dovresti capire i suoi principi di funzionamento, i passaggi della sua procedura e i suoi principali parametri operativi.
Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
