Le retard sur gel (EMSA)
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Overview
L’analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est une procédure biochimique utilisée pour élucider la liaison entre les protéines et les acides nucléiques. Dans cet essai un radiomarquées acides nucléiques et des protéines de test sont mélangés. Liaison est déterminée au moyen de l’électrophorèse sur gel qui sépare les composants basés sur la masse, charge et conformation.
Cette vidéo montre les notions d’EMSA et une procédure générale, y compris la détection, la liaison, l’électrophorèse et préparation de gel et de protéines. Les applications couvertes dans cette vidéo comprennent l’analyse des enzymes de remodelage de la chromatine, a mis à jour le EMSA qui intègre biontinylation et l’étude des sites des régulateurs bactériens réponse de liaison.
L’AESM, l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique, également connu sous le nom l’analyse de décalage de gel, est une procédure biochimique polyvalente et sensible. EMSA élucide la liaison entre les protéines et les acides nucléiques en détectant un changement dans les bandes en électrophorèse sur gel.
Cette vidéo décrit les principes de l’AESM, prévoit une procédure générale et traite de certaines applications.
Réplication de l’ADN, transcription et de réparation, ainsi qu’ARN est des processus biochimiques tout critiques. Ils sont tous impliquent la liaison entre les protéines et les acides nucléiques. Beaucoup de maladies graves et de troubles sont associés à des modifications dans cette liaison. L’AESM est une technique pour la détermination qualitative si une protéine spécifique se lie à un acide nucléique. Tout d’abord, l’acide nucléique est étiqueté, généralement avec le phosphore radioactif-32, pour créer une sonde. Ensuite, le test de protéine et acide nucléique sonde sont mélangés. Lorsqu’une protéine se lie à une acide nucléique de sonde, le complexe qui en résulte a une plus grande masse et une conformation différente que l’acide nucléique seul.
Une fois lié, les complexes sont analysés par électrophorèse sur gel. Dans cette technique, un champ électrique force macromolécules à migrer sur une matrice de gel. Les composants séparent sur la base de masse, charge et conformation. L’électrophorèse peut séparer des complexes protéine-ADN de sondes non liés. Puisqu’ils ont des conformations et masses différentes, ils migrent à travers le gel à des rythmes différents et séparés. La séparation est facile à déceler, grâce à la présence du phosphore radioactif et prouve que la protéine se lie avec succès à l’acide nucléique donné. Pour vérifier l’identification de la protéine, un « supershift » utilise un anticorps avec une affinité connue à la protéine. Cela a l’avantage supplémentaire de passer outre le complexe, en augmentant la résolution.
Maintenant que nous avons vu les principes, nous allons le voir dans le laboratoire.
Pour commencer la procédure, la protéine doit être isolée. Pour ce faire, des techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour exprimer la protéine dans les cellules et ensuite purifier.
L’acide nucléique est amplifié et étiqueté de manière à créer une sonde. L’étiquetage se fait grâce à une incubation de 10 min avec dCTP contenant du phosphore radioactif-32. Un rayonnement sécurisé établi et un équipement de protection sont requis.
Le gel est alors établi. Le gel doit être non dénaturants, afin d’empêcher la protéine altérant la conformation et potentiellement la séparation de la sonde pendant l’électrophorèse. Gels de polyacrylamide ont la taille des pores de 5 à 20 nm et sont utile pour les sondes courtes jusqu’à 100 paires de bases en longueur. Des gels d’agarose ont la taille des pores de 70 à 700 nm et sont utiles pour les sondes plus grandes.
Avec les protéines et les acides nucléiques sonde maintenant préparé, nous procédons à la liaison. Préparer une solution de tampon TRIS et la protéine et la sonde sont ajoutés. Le pH doit être similaire à des conditions physiologiques et concentration de sel suffisante pour empêcher la protéine formant des liaisons faibles avec des acides nucléiques non ciblés. La réaction se produit pendant 20-30 min à 4 ° C.
L’étape suivante est l’électrophorèse. Une zone tampon de faible force ionique et un pH identique à celui utilisé dans la réaction de liaison est utilisée. Il donne un « effet de mise en cage » qui stabilise complexes, augmente la mobilité et réduit la production de chaleur. Après électrophorèse, les composants du gel sont transférées sur du papier filtre. Dans une pièce sombre, le papier filtre est ensuite exposé au cinéma. Si la protéine se lie à la sonde, deux régions distinctes de marqués seront visibles dans le transfert. Représentant le complexe et une distincte représentant la sonde non liée. La séparation montre que la protéine a été liée à l’acide nucléique.
Maintenant que nous avons vu la procédure de base, nous allons étudier certaines applications.
La chromatine est le complexe serré de l’ADN et les protéines des cellules eucaryotes. Enzymes de remodelage de la chromatine modifient la structure pour ouvrir l’ADN à la transcription. Que cela change la mobilité du complexe, EMSA permet d’explorer l’activité de liaison de l’enzyme.
Une autre approche à l’étiquetage tire profit de l’interaction entre l’ADN et l’enzyme méthyltransférase. Un cofacteur peut être modifié pour lier en permanence à l’ADN par l’intermédiaire de methyltransferase. Au lieu de marquage avec le phosphore-32, le cofacteur est conjugué à la biotine, qui est avantageux, car il n’est pas radioactif. Parce que le cofacteur est spécifique au site dans son attachement, il est pertinent de génotypage, détection de méthylation et la livraison de gène. Les acides nucléiques de biotinilated sont détectés par fluorescence ultraviolette.
Lorsque les stimuli environnementaux activent kinases de l’histidine, un « régulateur de réponse » est phosphorylé. C’est à son tour lie à l’ADN, affectant la transcription, qui peut être étudiée par l’EMSA. Par exemple, un régulateur de réponse chez Desulfovibrio vulgaris a été démontré à lier le gène d’intérêt. EMSA a été utilisée pour vérifier que la liaison a eu lieu.
Vous avez juste regardé la vidéo sur l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique de JoVE. Vous devez maintenant comprendre ses principes de fonctionnement, les étapes de sa procédure et ses principaux paramètres de fonctionnement.
Merci de regarder !
Procedure
Disclosures
Transcript
EMSA, the electrophoretic mobility shift assay, also known as the gel shift assay, is a versatile and sensitive biochemical procedure. EMSA elucidates binding between proteins and nucleic acids by detecting a shift in bands in gel electrophoresis.
This video describes the principles of EMSA, provides a general procedure, and discusses some applications.
DNA replication, transcription, and repair, as well as RNA processing are all critical biochemical processes. They all involve binding between proteins and nucleic acids. Many serious diseases and disorders are associated with modifications in this binding. EMSA is a technique for qualitatively determining whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled, usually with radioactive phosphorus-32, to create a probe. Then the test protein and nucleic acid probe are mixed. When a protein binds to a nucleic acid probe, the resulting complex has greater mass and a different conformation than the nucleic acid alone.
Once bound, the complexes are analyzed with gel electrophoresis. In this technique, an electric field forces macromolecules to migrate through a gel matrix. The components separate based on mass, charge, and conformation. Electrophoresis can separate protein-DNA complexes from unbound probes. Since they have different masses and conformations, they will migrate through the gel at different rates and separate. The separation is easily detected, thanks to the presence of the radioactive phosphorus, and proves the protein successfully binds to the given nucleic acid. To verify the identification of the protein, a “supershift assay” uses an antibody with a known affinity to the protein. This has the added benefit of further shifting the complex, increasing resolution.
Now that we’ve seen the principles, let’s see it in the lab.
To begin the procedure, the protein must be isolated. To do this, molecular biology techniques are used to express the protein in cells, and then purify.
The nucleic acid is amplified and labeled to create a probe. Labeling is done through incubation for 10 min with dCTP containing radioactive phosphorus-32. A radiation-safe workbench and protective equipment are required.
The gel is then prepared. The gel needs to be non-denaturing, to prevent the protein from altering conformation and potentially unbinding from the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of 5 to 20 nm and are useful for short probes up to 100 base pairs in length. Agarose gels have pore sizes of 70-700 nm and are useful for larger probes.
With the protein and nucleic acid probe now prepared, we proceed to binding. A TRIS buffer solution is prepared and the protein and probe are added. The pH should be similar to physiological conditions, and salt concentration sufficient to prevent the protein from forming weak bonds with non-target nucleic acids. The reaction proceeds for 20-30 min at 4 °C.
The next step is electrophoresis. A buffer of low ionic strength and a pH similar to that used in the binding reaction is utilized. It yields a “caging effect” that stabilizes complexes, increases mobility, and reduces heat generation. After electrophoresis, the components of the gel are transferred onto filter paper. In a dark room, the filter paper is then exposed to film. If the protein binds to the probe, two distinct labeled regions will be visible in the transfer. One representing the complex, and a separate one representing the unbound probe. The separation demonstrates that the protein successfully bound to the nucleic acid.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
Chromatin is the tightly packed complex of DNA and proteins found eukaryotic cells. Chromatin-remodeling enzymes modify the structure to open the DNA to transcription. As this changes the mobility of the complex, EMSA can be used to explore the binding activity of the enzyme.
An alternate approach to labeling takes advantage of the interaction between DNA and the methyltransferase enzyme. A cofactor can be modified to bind permanently to DNA via methyltransferase. Rather than labeling with phosphorus-32, the cofactor is conjugated to biotin, which is advantageous because it’s not radioactive. Because the cofactor is site-specific in its attachment, it’s relevant to genotyping, methylation detection, and gene delivery. The biotinilated nucleic acids are detected through ultraviolet fluorescence.
When environmental stimuli activate histidine kinases, a “response regulator” is phosphorylated. This in turn binds to DNA, affecting transcription, which can be studied by EMSA. For instance, a response regulator in Desulfovibrio vulgaris was demonstrated to bind to the gene of interest. EMSA was used to verify that the binding took place.
You’ve just watched JoVE’s video on the electrophoretic mobility shift assay. You should now understand its principles of operation, the steps in its procedure, and its major operating parameters.
Thanks for watching!
