Co-inmunoprecipitación y el análisis Pull-Down

Biochemistry

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Summary

Co-inmunoprecipitación (CoIP) y ensayos de pull-down son métodos de cerca relacionados para identificar las interacciones proteína-proteína estable. Estos métodos están relacionados con inmunoprecipitación, un método para la separación de una proteína diana ligada a un anticuerpo de proteínas independientes. En CoIP, una proteína anticuerpo está obligado a otra proteína que no se une con el anticuerpo, esto es seguido por un proceso de separación que conserva las proteínas complejas. La diferencia en los ensayos de pull-down es que cebo etiqueta de afinidad proteínas sustituir los anticuerpos, y cromatografía de afinidad se utiliza para aislar los complejos de proteínas.

Este video explica CoIP, ensayos de pull-down y su aplicación en el laboratorio. Un protocolo paso a paso de cada técnica está cubierto, incluyendo reactivos, aparatos e instrumentos utilizados para purificar y analizar proteínas encuadernadas. Además, la sección de aplicaciones de este video describe un procedimiento para estudiar cómo las proteínas myxovirus inhiben la nucleoproteína de la gripe, una investigación sobre el papel de los iones del calcio en calmodulina por medio de un análisis descendente y un ensayo modificado de desplegable para caracterizar las interacciones transitorias de proteínas.

Las interacciones proteína-proteína juegan un papel importante en una amplia variedad de funciones biológicas. La mayoría de las interacciones proteína-proteína y sus efectos biológicos tiene todavía ser identificado. Co-inmunoprecipitación, o CoIP y ensayos de pull-down son dos métodos estrechamente relacionados para la identificación de las interacciones proteína-proteína estable. Este video cubre los principios de los dos ensayos, sus procedimientos de laboratorio general y aplicaciones de estas técnicas.

CoIP y ensayos de pull-down son variantes de inmunoprecipitación, un método para aislar selectivamente a una especie de proteína de una solución compleja. En un experimento de inmunoprecipitación, un anticuerpo específico para una proteína de la blanco se permite para formar un complejo inmune con ese objetivo en la muestra. El complejo es capturado en un soporte sólido, normalmente proteína un límite a un grano de sefarosa. Cualquier proteínas capturadas no se retiran por pasos de centrifugación. La proteína se libera luego del anticuerpo y el soporte sólido por ebullición en la reducción de buffer de muestra-cargamento SDS-PAGE.

Co-inmunoprecipitación se realiza de la misma manera, excepto que los complejos de la proteína intacta son capturados sobre el soporte sólido. El anticuerpo se une a la proteína diana, que, a su vez, está ligada a otra proteína que no está dirigida el anticuerpo. Como inmunoprecipitación, el complejo de la proteína se libera del anticuerpo y el soporte sólido por ebullición en la reducción de tampón de carga de SDS-PAGE.

Ensayos de pull-down son similares a la co-inmunoprecipitación, difiriendo sólo en el uso de una proteína "cebo", frente a un anticuerpo. A través de técnicas de biología molecular, esta proteína cebo está diseñada con una etiqueta de afinidad, como una serie de residuos de histidina. Estas etiquetas de afinidad se describen en "separaciones de biomoléculas basados en cromatografía." La proteína es capturada en un ligando de afinidad inmovilizado específico para la etiqueta. La proteína capturada luego se incuba con una muestra que contiene las proteínas que forman complejos con el "cebo". El complejo de la proteína se libera con el apoyo de la afinidad por lavado con una solución que contiene un analito competitivo específico para la etiqueta de la proteína "cebo". Ensayos de pull-down son útiles para confirmar las interacciones proteína predichas por la co-inmunoprecipitación y para descubrir las interacciones entre proteínas desconocidas.

Ahora que se han discutido los principios de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down, echemos un vistazo a sus procedimientos de laboratorio.

Primero hablemos de co-inmunoprecipitación. A una serie de tubos de microcentrífuga, se añade lo siguiente: tampón PBS y una solución de 50% de la proteína A-sefarosa, un complejo de resina-proteína que se une al anticuerpo. Los tubos del microfuge se rotan para asegurar la adecuada distribución, y luego la resina se lava con buffer PBS adicional. Lisado, que contiene la proteína deseada, de la célula y 2 μg de anticuerpo se añaden a los tubos de microcentrífuga y se gira la mezcla por 1 h a 4 ° C. Los granos son peleteados por centrifugación, el sobrenadante se descarta y los granos re lavaron tres veces con tampón para eliminar proteínas sin límite. Los granos que contiene el complejo anticuerpo-proteína son en la reducción de buffer de muestra-cargamento SDS-PAGE, para el retiro del complejo de los anticuerpos y para el análisis por SDS-PAGE y el immunoblotting.

Ahora vamos a discutir el procedimiento para los ensayos de pull-down: la proteína de "cebo" se expresa en un plásmido con la etiqueta de afinidad adecuada. Después de alcanzar el crecimiento de la fase logarítmica, las células son sometidas a lisis y luego centrifugadas. Granos de la estreptavidina-sefarosa suspendidos, que capturan la biotina etiquetado proteína de "cebo", se pipetea en un tubo de microcentrífuga. Los granos entonces se centrifugaron y el sobrenadante cuidadosamente removido por aspiración. Los granos entonces se lavan con buffer, centrifugado y el sobrenadante eliminado.

Las células que contienen la proteína supuesta del "presa", que tiene una afinidad para la proteína de "cebo", se cosechan por centrifugación. El sobrenadante es añadido al tubo de microcentrífuga conteniendo la resina y se incubó a 4 ° C por 3 h en un agitador. La resina es centrifugado, retirar el sobrenadante y lava la resina para eliminar proteínas sin límite. Tampón de elución se agrega a la resina, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador. La resina entonces se centrifuga y el sobrenadante que contiene el complejo deseado es analizado por immunoblotting.

Ahora que hemos analizado los procedimientos, Veamos algunas de las aplicaciones útiles de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down.

Co-inmunoprecipitación puede ser útil en la comprensión del mecanismo de acción de enzimas. Proteínas de resistencia myxovirus, o Mx, inhiben una amplia gama de virus, incluyendo influenza A, para que el mecanismo es mal entendido. Co-inmunoprecipitación se utilizó para estudiar la interacción entre el ratón proteína Mx1 y nucleoproteína de la gripe.

Ensayos de pull-down han demostrado ser útiles en el estudio de los efectos de los segundos mensajeros, que son proteínas que comunican una señal del entorno celular. Son un componente de una vía de señalización donde múltiples proteínas interactúan en respuesta a señales ambientales. Los iones de calcio actúan como mensajeros secundarios al unirse a la calmodulina, que a su vez, se une a una gran variedad de proteínas, mediando muchos tipos de respuestas biológicas. Sin el calcio, la proteína no puede unirse a la calmodulina. Se realizó un análisis pull-down para poner a prueba la capacidad de las proteínas se unen a calmodulina en la presencia o ausencia de iones calcio.

Co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down generalmente se utilizan para el análisis de las interacciones de la proteína estable o fuerte, pero no transitoria. Un desarrollo reciente en los ensayos de pull-down, HaloTag, ha simplificado el estudio de las interacciones transitorias de proteínas; HaloTag es una etiqueta de fusión de proteínas codificadas genéticamente, fusionada a la proteína de interés, capaces de reaccionar químicamente con un soporte sólido de haloalkane. Si se desea el análisis funcional, la proteína compleja, menos la etiqueta, en su totalidad podría entonces ser aislada por incubación con tabaco etch proteasa de virus.

Sólo has visto video de Zeus de co-inmunoprecipitación y el análisis pull-down. Este video describe los principios de los dos métodos, los procedimientos de laboratorio general y algunas de sus aplicaciones.

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JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Co-inmunoprecipitación y el análisis Pull-Down. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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