Co 免疫沈降法とプルダウンの試金
English
Share
Overview
Co-免疫沈降 (CoIP) プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するために密接に関連するメソッドです。これらのメソッドは、免疫沈降、抗体と結合した自由な蛋白質からターゲット蛋白質を分離する方法に関連しています。CoIP、抗体結合蛋白質は抗体と結合しない別の蛋白質にバインド自体、これはタンパク質タンパク質を保持する分離プロセスによって、続いて複雑な。プルダウンの試金の違いは餌の親和性タグ付きタンパク質を交換して、抗体、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質蛋白質の複合体を分離するために使用します。
このビデオでは、CoIP、プルダウンの試金、および研究室での実装について説明します。試薬、装置、浄化し、バインドされた蛋白質を分析するために使用楽器など、各テクニックの手順プロトコルが覆われています。このビデオのアプリケーション セクションが myxovirus 蛋白質がインフルエンザ蛋白、プルダウンの試金および変更されたプルダウン法を介してカルモジュリンにおけるカルシウム イオンの役割の捜査を阻害する方法を研究するための手順をについて説明しますさらに、一時的な蛋白質の相互作用を特徴付けます。
蛋白質蛋白質の相互作用は、さまざまな生物学的機能に重要な役割を再生します。蛋白質蛋白質の相互作用とその生体影響の大半は、識別することまだあります。Co-免疫沈降、または CoIP、プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するための 2 つの密接に関連方法です。このビデオは、2 つの試金、一般的な検査手順、およびこれらの技術の応用の原理を説明します。
CoIP プルダウン ・ アッセイは、免疫沈降、複雑なソリューションからの蛋白質種を選択的に分離する方法のバリエーション。免疫沈降実験では、サンプルでそのターゲットと免疫複合体を形成する標的蛋白質への抗体となっています。複合体は、通常タンパク質セファローズ ビーズにバインドされている、固体のサポートにキャプチャされます。キャプチャされていない任意のタンパク質は、遠心分離の手順で削除されます。タンパク質は、SDS ページ サンプル読み込みバッファーを減らす沸騰によって抗体および固体のサポートから解放されます。
そのまま蛋白質複合体が固体のサポートにキャプチャされる点を除いて、Co 免疫沈降は同じ方法で行われています。抗体は、ターンでは、抗体のない対象となる別の蛋白質にバインドされているターゲット蛋白質にバインドします。免疫沈降のように蛋白質の複合体は SDS-PAGE サンプルバッファーの読み込みを減らす沸騰によって抗体と固体のサポートから解放されます。
プルダウン アッセイは、co-免疫沈降、抗体ではなく、「餌」蛋白質の使用でのみが異なるに似ています。分子生物学的手法によるこのタンパク質の餌は、ヒスチジンの残余のシリーズなどの親和性タグと設計されています。これらの親和性の札、「生体分子分離クロマトグラフィー ベース」で説明タンパク質は、固定化のアフィニティーリガンド タグのために特定のキャプチャされます。キャプチャされたタンパク質を「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルでインキュベーションします。蛋白質の複合体は、「餌」タンパク質にタグの特定の競争力のある検体を含む溶液で洗浄することにより親和性サポートから解放されます。プルダウン アッセイは、co-免疫沈降によって予測された蛋白質の相互作用を確認するため、未知の蛋白質の相互作用を発見するために役立ちます。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイの原理が説明されている、今は実験室プロシージャを見てみましょう。
最初 co 免疫沈降を説明しましょう。一連の microfuge の管の次の追加: PBS バッファー、および蛋白抗体に結合する樹脂タンパク質複合体、即ち 50% 溶液です。適切な配分を確保するため microfuge の管が回転して、追加の PBS バッファーで樹脂を洗浄するし。細胞ライセート、目的のタンパク質を含むと 2 μ g の抗体が microfuge の管に追加され、混合物は 4 ° C で 1 時間の回転遠心分離によってビーズをペレット、上清を捨て、ビーズ 3 回洗浄バッファーを非バインド タンパク質を削除して再。抗体蛋白質の複合体を含むビーズは、SDS ページ サンプル読み込みバッファー、抗体の複合体の除去、SDS-PAGE とイムノブロット解析を減らすことです。
今、プルダウンの試金のための手順について説明します:「餌」タンパク質は適切な親和性タグとプラスミドで表されます。ログ相成長を達した後セルを溶解し, して遠心し。「餌」タンパク質のビオチン タグをキャプチャ、中断されたストレプトアビジン セファローズ ビーズがおよび microfuge の管に戻します。ビーズは遠心し、上清を吸引により慎重に削除します。それから、ビーズはバッファー、遠心、上清除去と洗浄されます。
「餌」タンパク質の親和性を持っていると推定される「獲物」タンパク質を含むセルは、遠心分離によって収穫されています。上澄みは、樹脂を含むおよび microfuge の管に追加し、シェーカーで 3 h の 4 ° C で培養しました。樹脂は、遠心、上清除去し、樹脂非バインド蛋白質を取除くことを洗浄します。樹脂に溶出バッファーが追加され、混合物はシェーカー上で 30 分間室温でインキュベートします。樹脂は遠心し、目的の複合体を含む上清をイムノブロット分析します。
今では手順を確認しましたところ、co 免疫沈降法とプルダウン ・ アッセイの有用なアプリケーションのいくつかを見てみましょう。
Co 免疫沈降は、酵素の作用機序の理解を深めるに役立ちます。Myxovirus-、または Mx-の抵抗蛋白質を阻害メカニズムはよく理解されていないインフルエンザを含むウイルスの広い範囲。Co 免疫沈降は、マウス Mx1 タンパク質とインフルエンザ蛋白間相互作用の研究に使用されました。
プルダウンの試金は、携帯電話の環境からの信号を通信する蛋白質である第 2 メッセンジャーの効果の研究に役立っています。彼らは、複数のタンパク質が環境手がかりに応えて対話するシグナル伝達経路のコンポーネントです。カルシウム イオンは、多くの種類の生物学的反応を仲介するターンでは、さまざまなタンパク質に結合するカルモジュリンに結合して二次メッセンジャーとして機能します。せず、カルシウム、タンパク質は、カルモジュリンにバインドできません。
Co 免疫沈降法とプルダウンの試金は通常がない一時的なものの安定・強力な蛋白質の相互作用の分析に使用されます。HaloTag、プルダウン法の最近の発展は一時的な蛋白質の相互作用の研究を簡素化します。HaloTag 固体支持体ハロゲン化アルキルと反応して化学的にことができる興味の蛋白質に溶ける、遺伝子にコードされたタンパク質融合タグであります。蛋白質の複合体、そのままの状態で、タグ マイナスでしたそれから隔離する機能解析が必要な場合にたばこの孵化によってウイルスのプロテアーゼをエッチングします。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイのゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、2 つの方法、一般的な研究室プロシージャ、およびアプリケーションのいくつかの原則を説明します。
見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
Thanks for watching!
