Immunoprécipitation d'un complexe de protéines (co-IP) avec ou sans marqueur (tag)
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Overview
Co-immunoprécipitation (Pico) et menu déroulant dosages sont étroitement apparentées de méthodes pour identifier les interactions protéine-protéine stable. Ces méthodes sont liées à l’immunoprécipitation, une méthode pour séparer une protéine cible liée à un anticorps des protéines non liés. Pico, une protéine de liaison anticorps est liée à une autre protéine qui ne se lie pas avec l’anticorps, il est suivi par un processus de séparation qui préserve les protéines complexes. La différence dans les essais de la liste déroulante est que protéines d’affinité-tag appât remplacement anticorps et chromatographie d’affinité est utilisée pour isoler des complexes protéine-protéine.
Cette vidéo explique Pico, menu déroulant dosages et leur mise en œuvre dans le laboratoire. Un protocole étape par étape pour chaque technique est couvert, y compris les réactifs, les appareils et les instruments permettant de purifier et d’analyser les protéines liées. En outre, la section des applications de cette vidéo décrit une procédure pour étudier comment les protéines myxovirus inhibent la nucléoprotéine de grippe, une enquête sur le rôle des ions de calcium à la calmoduline via un menu déroulant dosage et d’un test mis à jour le menu déroulant pour caractériser les interactions entre protéines transitoires.
Interactions protéines-protéines jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La plupart des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques doivent encore être identifiés. Co-Immunoprécipitation, ou Pico et menu déroulant dosages sont deux méthodes apparentées pour l’identification des interactions protéine-protéine stable. Cette vidéo couvre les principes des deux essais, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Pico et menu déroulant dosages sont des variantes d’immunoprécipitation, une méthode pour isoler sélectivement une espèce de protéine d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, un anticorps spécifique d’une protéine cible est autorisé pour former un complexe immun avec cet objectif dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine une limite d’une bille de Sépharose. Aucune protéine ne pas capturées est éliminées par étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et le support solide en faisant bouillir dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE.
Co-immunoprécipitation est réalisée de la même façon, sauf que les complexes de protéine intacte sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et le support solide en portant à ébullition pour réduire la mémoire tampon échantillon de chargement SDS-PAGE.
Menu déroulant essais sont similaires aux co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Par le biais de techniques de biologie moléculaire, cette protéine appât est conçue avec une balise d’affinité, comme une série de résidus histidine. Ces balises d’affinité sont décrites dans « axée sur la chromatographie des séparations de biomolécule ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand immobilisé affinité spécifique pour la balise. La protéine capturée est ensuite incubée auprès d’un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec le « appât ». Le complexe protéique est libéré de la prise en charge de l’affinité de lavage avec une solution contenant un spécifique de l’analyte compétitif pour la balise sur la protéine « appât ». Menu déroulant dosages sont utiles afin de confirmer les interactions protéine prédites par co-immunoprécipitation et pour découvrir les interactions de protéine inconnue.
Maintenant que les principes de co-immunoprécipitation et menu déroulant dosages ont été discutées, regardons leurs procédures de laboratoire.
Première nous allons discuter de co-immunoprécipitation. À une série de microtubes, le texte suivant est ajouté : tampon PBS et une solution de 50 % de protéine A-Sépharose, un complexe de résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les microtubes sont tournées pour assurer la distribution correcte, et puis la résine est lavée avec tampon PBS supplémentaire. Cellule lysat, contenant la protéine désirée et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux microtubes et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 ° C. Les perles sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les perles re-laver trois fois avec le tampon à supprimer non lié aux protéines. Les perles contenant le complexe protéine-anticorps sont dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, pour enlèvement du complexe de l’anticorps et analyse par SDS-PAGE et immunoblotting.
Maintenant, nous allons discuter de la procédure pour des dosages de menu déroulant : la protéine « appât » s’exprime dans un plasmide avec la balise appropriée d’affinité. Après avoir atteint la croissance phase logarithmique, les cellules sont lysées et puis centrifugés. Streptavidine-Sépharose suspension perles, qui capturent de protéine de biotine-étiquetée « appât », sont distribués dans un tube à centrifuger. Les perles sont ensuite centrifugés et le surnageant sera enlevé par aspiration. Les perles sont ensuite lavées avec tampon, centrifugé et le surnageant supprimé.
Les cellules contenant la protéine putative de « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté à du tube à centrifuger contenant de la résine et incubé à 4 ° C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugé, le surnageant supprimé, et la résine lavé pour enlever non lié aux protéines. Tampon d’élution est ajouté à la résine, et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe désiré est analysé par immunoblotting.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, nous allons étudier certaines applications utiles de co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant.
Co-Immunoprécipitation peut être utile dans la compréhension des mécanismes des enzymes d’action. Protéines de résistance Myxovirus ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. Co-Immunoprécipitation a été utilisé pour étudier l’interaction entre la souris protéine Mx1 et la nucléoprotéine grippe.
Menu déroulant dosages sont avérés utiles pour étudier les effets de seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal provenant de l’environnement cellulaire. Elles constituent un élément d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des stimuli environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiation de nombreux types de réponses biologiques. Sans le calcium, la protéine ne peut pas lier à la calmoduline.
Co-Immunoprécipitation et menu déroulant dosages sont généralement utilisés pour l’analyse des interactions de protéine stable ou forte, mais pas transitoire. Un développement récent dans le menu déroulant dosages, la HaloTag, a simplifié l’étude des interactions entre protéines transitoires ; HaloTag est une balise de fusion de protéine codée génétiquement, fondue à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide haloalcanes. Si vous souhaitez l’analyse fonctionnelle, la protéine complexe, moins l’étiquette, dans son intégralité pourrait alors être isolée en incubant avec tabac etch protéase du virus.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant. Cette vidéo décrit les principes de deux méthodes, les procédures générales de laboratoire et certaines de leurs applications.
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Procedure
Disclosures
Transcript
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
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