Summary
Deze video beschrijft een eenvoudige, tijdsbesparende techniek voor automatische weefsel dissociatie met behulp van de gentleMACS Dissociator naar single-cell suspensies van de muis splenocyten voor te bereiden.
Abstract
Single-cell suspensies zijn een voorwaarde voor experimenten in cel scheiding, cel-cel-analyse en cultuur. Om te voorkomen dat vervelende en vaak pijnlijke handleiding dissociaties de gentleMACS Dissociator maakt het mogelijk om weefsel los te zeer efficiënt onder gecontroleerde en reproduceerbare omstandigheden. De gentleMACS Dissociator optimaal kan dissociëren muis-milt, een combinatie van tijdbesparende en normalisatie met user-veiligheid. Deze video wordt beschreven hoe u de muis los te milten het gebruik van de gentleMACS Dissociator, een geautomatiseerde bench-top apparaat dat mechanisch kunnen verstoren weefsels met behulp van speciale buizen aan levensvatbare celsuspensies te produceren. Naar aanleiding van dissociatie, zijn milt gefilterd, gecentrifugeerd en geresuspendeerd voor verdere toepassingen.
Protocol
Inleiding tot Equipment
- Weefsel is zacht gedissocieerd, met behulp van violet C Buizen in levensvatbare eencellige suspensies.
- De PBS / BSA EDTA buffer wordt gebruikt om de cellen te scheiden. De buffer is bereid door toevoeging van een onderdeel van BSA Stock oplossing voor de 20 delen van autoMACS spoeloplossing met EDTA.
- De MACS Pre-Scheiding Filters worden gebruikt, zodat de gedissocieerde weefselmonsters zijn vrij van alle cel klonten, het bevorderen van een succesvolle MACS scheiding en daaropvolgende analyse.
Dissociatie de milt-cellen
- Hele milt worden disscociated in single-cell suspensies van splenocyten het gebruik van de gentleMACS Dissociator.
- Om te beginnen van de procedure, laad de C Tube met een volume van buffer op basis van de massa van de milt. Een gezonde milt van een jonge volwassen vrouw BALB / c muis weegt ongeveer 80 tot 120 mg. Elke 1 tot 2 milten van deze massa moet 3 ml buffer. Milt van oudere dieren of dieren met infecties zijn vaak groter en moeten worden afgewogen in buffer. De buffer volumes moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Niet meer dan in totaal buffer volume van 10 ml.
- Voeg de ontleed milt van de C Tube met 3 ml buffer.
- Zorg ervoor dat de C-Tube kap strak is en bevestig de C Tube aan de dissociator met de dop naar beneden.
- Het opstarten van de dissociator. Voor 1-2 milt, selecteert u het programma m_spleen_01. Het programma duurt 56 seconden in beslag. Als het aantal van de milt groter is, gebruik van het programma m_spleen_04, dit programma kan gebruikt worden voor maximaal 720 mg van de milt weefsel.
- Na afronding van het programma de inheemse milt weefsel is gedissocieerd in een splenocyten schorsing.
- Spin down van de hele cel suspensie bij 300xg bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 sec. Dit zal ervoor zorgen dat de rotor en de stator zijn ontdaan van alle cellen die worden verzameld op de bodem van de C-Tube.
- Verwijder het monster door het septum afgesloten opening in de C-Tube dop met behulp van een 1000 microliter pipetter.
Filtratiestap
- Om te beginnen de filtratie stap, gelden de gedissocieerde weefsel om de Pre-filter Separation of een cel zeef met 30 micrometer poriegrootte. Het filter moet passen een 15 mL buis voor 1-2 milt of een 50 mL buis voor meer dan 2 milt.
- Laat de celsuspensie passeren. Was daarna de filter door het toepassen van 5 ml van de buffer.
- Nu, centrifuge de buis met de celsuspensie op 300xg, bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten aan alle splenocyten verzamelen in een milt celpellet.
- Nu, dat we een pellet van gescheiden splenocyten hebben, moeten we het supernatans aspireren en resuspendeer de cel pellet in een geschikte hoeveelheid van de buffer.
Milt dissociatie met behulp van de gentleMACS Dissociator levert een hoog percentage van levensvatbare splenocyten, die wordt aangetoond door middel van flowcytometrie met behulp van de MACSQuant Analyzer. Dode cellen worden gekleurd door propidiumjodide. In de verstrekte voorbeeld, de voorwaartse zijwaartse verstrooiing dot plot toont de voorbereide splenocyten.
Discussion
Om te voorkomen dat vervelende en vaak pijnlijke handleiding dissociaties, de gentleMACS Dissociator maakt het mogelijk om weefsel los te zeer efficiënt onder gecontroleerde en reproduceerbare omstandigheden. Het weefsel dissociatie procedure is zacht voor cellen en levert celsuspensies met een hoge levensvatbaarheid tarief. De gentleMACS Dissociator in combinatie met C Tubes is ontworpen voor de bereiding van single-cell schorsingen van verschillende weefsels. Het instrument is uitgerust met een aantal vooraf ingestelde programma's om muis-milt-, lever-, long-of zenuwweefsel distantiëren. Het bereik van de programma's en protocollen zal voortdurend worden uitgebreid met extra weefsels te nemen.
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS™ Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx |
| 13 mL Tubes | Miltenyi Biotec | 130-091-596 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx |
| autoMACS™ Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx |
| MACS® BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
| Propidium Iodide Solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
