Summary
Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.
Abstract
De uma única célula suspensões são um pré-requisito para experimentos na separação de células, a análise de células e cultura de células. Para evitar dissociações manual tedioso e doloroso o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O Dissociator gentleMACS pode perfeitamente dissociar baço mouse, combinando economia de tempo e padronização com segurança do usuário. Este vídeo descreve como dissociar baços mouse usando o Dissociator gentleMACS, um dispositivo de bancada automatizado que pode atrapalhar mecanicamente tecidos utilizando tubos especiais para produzir suspensões de células viáveis. Após a dissociação, baços são filtradas, centrifugadas e ressuspendidas para outras aplicações.
Protocol
Introdução ao Equipamento
- Tecido é cuidadosamente dissociada, utilizando tubos de violeta C em uma única célula viável suspensões.
- O PBS / BSA-tampão de EDTA é utilizado para dissociar as células. O buffer é preparada por adição de 1 parte de solução de BSA estoque para 20 partes de autoMACS lavagem solução contendo EDTA.
- O MACS pré-separação Filtros são usados para que as amostras de tecido dissociado estão livres de todos os aglomerados de células, promovendo a separação MACS sucesso e posterior análise.
Dissociar as células do baço
- Baços todo são disscociated em uma única célula suspensões de esplenócitos usando o Dissociator gentleMACS.
- Para iniciar o procedimento, coloque o tubo C com um volume de tampão de acordo com a massa do baço. Um baço saudável de um jovem adulto camundongo BALB / c fêmeas pesa cerca de 80-120 mg. Cada 1 a 2 baços dessa massa necessitam de 3 mL de tampão. Baços de animais mais velhos ou animais com infecções são muitas vezes maiores e devem ser pesados em buffer. Os volumes de buffer deve ser adaptado em conformidade. Não exceder o volume total do buffer de 10 mL.
- Adicione o baço dissecados para o tubo C contendo 3 ml de tampão.
- Certifique-se de que a tampa do tubo C é apertado e conecte o tubo C ao dissociator com a tampa para baixo.
- Ligue o dissociator. Por 1-2 baços, selecione m_spleen_01 programa. O programa terá 56 segundo para ser concluído. Se o número de baços é maior, usar o programa m_spleen_04; este programa pode ser usado para até 720 mg de tecido esplênico.
- Após a conclusão do programa, o tecido do baço nativa é dissociada em uma suspensão esplenócitos.
- Girar a suspensão de células inteiras em 300xg em temperatura ambiente por cerca de 30 seg. Isso irá garantir que o rotor eo estator são libertados de todas as células que são coletados na parte inferior do tubo C.
- Retirar a amostra através do septo, selada abertura da tampa do tubo C usando uma pipeta 1000 microlitro.
Etapa de filtração
- Para começar a etapa de filtração, aplicar o tecido dissociado para o Filtro de pré-separação ou um filtro de células com 30 mM tamanho dos poros. O filtro deve caber um tubo de 15 mL por 1-2 baços ou um tubo de 50 mL por mais de 2 baços.
- Deixe a suspensão de células passar. Em seguida, lave o filtro através da aplicação de 5 mL de tampão.
- Agora, centrifugar o tubo com a suspensão de células em 300xg, em temperatura ambiente por 10 minutos para coletar todos os esplenócitos em um baço pellet celular.
- Agora, que temos uma pelota de esplenócitos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade adequada de buffer.
Dissociação baço usando o Dissociator gentleMACS renderá uma elevada percentagem de esplenócitos viável, o que é demonstrado por citometria de fluxo usando o Analisador MACSQuant. Células mortas estão manchadas pelo iodeto de propídio. No exemplo fornecido, o atacante lado gráfico de pontos de dispersão mostra o esplenócitos preparado.
Discussion
Para evitar dissociações manuais entediantes e muitas vezes doloroso, o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O tecido procedimento de dissociação é suave para as células e suspensões colheitas de células com uma taxa alta viabilidade. O Dissociator gentleMACS em combinação com C Tubes é projetado para a preparação de uma única célula suspensões de vários tecidos. O instrumento é equipado com uma série de programas pré-definidos para dissociar baço mouse, fígado, pulmão, ou tecido neural. A gama de programas e protocolos será continuamente ampliado para incluir outros tecidos.
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS™ Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
| C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx |
| 13 mL Tubes | Miltenyi Biotec | 130-091-596 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx |
| autoMACS™ Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx |
| MACS® BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
| Propidium Iodide Solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
