Summary
Teslimi için cerrahi işlem embriyonik kök hücre elde edilen endotel hücreleri iskemik hindlimb biyoparlaklık görüntüleme ile non-invaziv takibi ile gösterilmiştir.
Abstract
Bacaklar ve ayaklar, oksijenli kan ve besin kaynağı periferik arterlerin daralması periferik arter hastalığı (PAH), Bu patoloji aralıklı topallama (yürüme ağrısı), ağrılı iskemik ülserasyonlar, hatta ekstremite tehdit eden bir kangren gibi semptomlara neden olur. Genellikle, tüm kan ve lenf damarlarının luminal yüzeyi yatırım endotel hücreleri bir tek tabaka, damar endotel, vasküler homeostazı ve vasküler rejenerasyon baskın bir rol oynadığı düşünülmektedir. Sonuç olarak, endotel hücre tabanlı rejenerasyon kök PAD tedavi için umut verici bir yaklaşım olabilir.
Bu video, embriyonik kök hücre nakli (ESC) göstermektedir elde edilen biyoparlaklık görüntüleme homing hücre ve hayatta kalma non-invaziv izleme takip PAD bir model olarak endotel hücreleri, tek taraflı hindimb iskemi tedavisi için. Hücre teslimat ve görüntüleme için özel malzemeler ve usulleri açıklanan olacaktır. Bu protokol Niiyama ark hindlimb iskemi indüksiyon açıklayan başka bir yayın izler. 1
Protocol
1. Endotel hücreleri içine fare EKH farklılaşma
- Endotel hücreleri EKH ayırt için protokol başka açıklanan ve bu protokol 2,3 odak değildir. Kısaca, hücrelerin ayırt etmek için izin verilir ve floresan aktif hücre sıralama (FACS), CD31 ya da vasküler endotelyal kaderin (VE-kaderin) gibi endotel işaretleri için pozitif hücreler daha sonra arıtılmış.
2. Double Fusion Reporter Gen ve lentiviral İletimi İnşaatı
- Biyoparlaklık ateşböceği lusiferaz (fluc) muhabiri genlerin ifade etmek için değiştirilmiş hücreler izlemek için kullanılabilir. Bu uygulama için, hücreleri bir iç ubikuitin organizatörü kontrol altında fluc ve gelişmiş hem de yeşil floresan protein (eGFP) füzyon gen içerir. Hücreleri değiştirmek için optimize önemli genetik unsurları içeren transgen lentiviral vektör yerine getirmek için biyo-güvenlik kriterleri artan transdüksiyon etkinliğinin yanı sıra, laboratuarda fluc eGFP füzyon muhabiri geni taşıyan geliştirilen PFU-FG vektör stabil bir şekilde kullanılabilir sonra hücrelerin farklılaşması transduce. Bu füzyon inşa nakledilen hücrelerin biyoparlaklık ve floresan izleme sağlar. Virüs parçacıkları, iletimi ve ifade muhabiri genlerin başka bir yerde 4 açıklanmıştır etiketli hücrelerinin üretimi üretmek için prosedür.
3. Iskemik hindlimb Transplantasyon ESC-endotel hücreleri
- Hücre nakli için hindlimb iskemi geçirdiği bir fare hazırlama prosedürü başlayın. Bunu yapmak için, anestezi indüksiyon odasına 1L/min bir akış hızında% 100 oksijen izofluran% 1-3 içeren fare yerleştirin.
- Dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Ardından indüksiyon odasından hayvan çıkarın.
- Daha sonra, işletim masaya yatar pozisyonda hayvan yer ve 1L/min bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 1-3 izofluran sürekli bir akış bağlamak.
- Üç alternatif betadin ve alkol scrubs hindlimb cilt silin.
- Cilt temizlendikten sonra fosfat 30 mcL bir milyon ESC edilen endotel hücreleri elde tamponlu salin (PBS). 28 iğne bu hücrelerin yükleyin.
- Hücrelerin hazır olduğunuzda, hafifçe kaldırın ve gastroknemius kas yerini daha iyi görselleştirmek için hindlimb uzatmak. Bacak uzatılmış olmakla birlikte, altta yatan kas içine deri yoluyla iğne takın. Kemik yaklaşım değil dikkat edin. Ve yavaşça gastroknemius 30 mcL hücre karışımı enjekte edilir. Intramüsküler enjeksiyon için, 30 mcL hacim enjekte edilebilir sınırı yakın. Deneyimlerimiz, şırınga iğneleri kaybı hacmi yok, çünkü nedenle, 28-gauge insülin şırıngaları tercih edilmektedir.
- Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, kurtarma kafesine fare dönmek ve uyanık kadar sürekli izlemek. Hayvan kurtarmak ve birkaç saat sonra nakledilen hücrelerin in vivo biyoparlaklık görüntüleme ile devam etmek için izin verin.
4. ESC edilen endotel hücreleri in vivo görüntüleme Biyoparlaklık
- Nakledilen ESC-türetilmiş endothelials hücreleri, bir iç ubikuitin organizatörü kontrol altında fluc ve eGFP füzyon gen ifade etmek için modifiye edilmiştir. Bu nedenle, biyoparlaklık iskemik hindlimb içinde hücreler izlemek için kullanılabilir.
- Bu adımı başlamak için, biyoparlaklık görüntüleme sistemi ve Yaşam Görüntü toplama yazılımı açın. Sonra toplama sistemi başlatmak ve görüş alanının boyutlarını belirtmek.
- Arka plan emisyon emmek için görüntüleme kutusu üzerine, yer siyah, mat kağıt.
- Görüntüleme kutusu hazır olduğunda fare 1L/min çıkış izofluran% 1-3 olarak oksijen içeren anestezi indüksiyon odasına koyun. Dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Ardından indüksiyon odasından hayvan çıkarın.
- Gerektiği gibi bir elektrikli tıraş makinesi ile her iki arka ayaklarında saç çıkarın.
- D-luciferase vücut ağırlığının gram başına 10 mcL periton içine enjekte edilir. D-luciferase 15 mg / mL PBS filtre stok çözelti içine önceden hazırlanmış.
- Luciferase enjekte edildikten sonra, hayvan izofluran, sürekli bir akış bağlı yatar pozisyonda siyah kağıt üzerinde görüntüleme kutuya koyun.
- Hayvan görüntü kutunun içine yerleştirilmesi ve izofluran için bağlanma.
- Görüntü doymuş olduğu bir optimum pozlama süresini belirlemek için 10-60 saniye görüntüleri elde etmek için Başlat. Görüntü doymuş hale gelirse, pozlama süresini azaltmak. Biyoparlaklık sinyal çok zayıfsa, pozlama süresi artar.
- Istimalsinyal maksimum ve sonra kaybolur ulaşıncaya kadar g en uygun pozlama süresi, resimlerin her 1-3 dakikada edinmeye devam. Satın alma işlemi tamamlandığında, dosyayı kaydedin.
- Verileri analiz etmek, enjeksiyon yerinde kapak ilgi alanları (ROI) seçin. Negatif kontrol olarak, benzer bir yatırım getirisi olmayan çalışan bacak için seçilebilir. Yazılımını kullanarak, her timepoint ROI'ler fotonlar / saniye / cm 2 / steradian (p / s / cm 2 / sr) birimleri cinsinden ifade edilir toplam parlaklığı, ölçer. Maksimum değeri son verileri kullanılmalıdır. Veriler de ileride kullanmak üzere, Excel elektronik tablo ihraç edilebilir.
- Bir kez tüm veriler elde edilir, hayvan kurtarma kafes ve hayvan uyanır kadar sürekli izlemek.
- Hücreler zaman içinde izlemek için bu prosedürü tekrarlayın.
- Istenilen bir zaman noktasında, hayvan doku fonksiyon değerlendirilmesi için ötenazi olabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Sol iskemik hindlimb nakledilen hücrelerin bir temsilcisi biyoparlaklık görüntü Şekil 1'de gösterilmiştir. Biyoparlaklık satın alınması sırasında, şiddeti zamanla artacak ve zaman seyri sırasında elde edilen maksimum değeri son değer olarak rapor edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EKH farklılaşma ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere her üç germ tabakasından oluşan hücre soylarının ortaya çıkmasına neden yeteneklerini plastisite nedeniyle doku iskemi tedavisi için umut vaat eden bir hücre kaynağı. EKH ile ilgili etik kaygıları aşmak için, bağlı pluripotent kök hücreleri (iPSCs) etik kaygılar üstesinden alternatif pluripotent kök hücre kaynağı olabilir. EKH yanı sıra, yetişkin kök hücreleri, endotel progenitör hücrelerin (EPC) ve hematopoetik kök hücreleri (HKH'lerin) gibi de kullanılabilir, ancak bu hücre tiplerinin PAD ile hastalara terapötik etkisi sınırlı olabilir. Hücre İntramüsküler teslim minimal invaziv ve gerçekleştirmek için kolay ve teslimat Bu modda da çözünür faktörler ya da plazmid teslim için uygun. Ancak, nakledilen hücrelerin, femoral arter veya kuyruk ven içine damar, sistemik teslimat kolay erişim için intramüsküler enjeksiyonlar yerine kullanılan olabilir.
Biyoparlaklık görüntüleme hücre sağkalım yüksek verim ve non-invaziv izleme performans avantajı sunuyor. Lazer Doppler kan perfüzyon veya neovaskülarizasyon histolojik analiz gibi fonksiyonel testleri ile kombine edildiğinde, bu tekniklerin birlikte araştırmacılar hindlimb iskemi kurtarma hücre nakli tedavi etkisini değerlendirmek için izin verebilirsiniz.
Sonuç olarak, biz hindlimb iskemi tedavisi için ESC edilen endotel hücreleri teslim ve izleme için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Hibe Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, Doktora ve teknik yardım için Stanford Küçük Hayvan Imaging Core teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca veteriner ekipman desteği için teşekkür ederiz. AM Bickford, Inc. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri araştırma hibeler (R01 HL-75.774, R01 CA098303, R21 HL085743 1K12 HL087746), California University of California (15IT-0257 ve 1514RT-0169) Tütün İlgili Hastalık Araştırma Programı tarafından desteklenen ve Rejeneratif Tıp California Institute (RS1-00.183).
NH bir burs Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmektedir. Kalp Derneği.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. JoVE. , (2008).
- Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).
- Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 408, 926-926 (2000).
- De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging. Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Med. 4, 245-247 (1998).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).
- Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113, 1005-1114 (2006).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
