Summary
De chirurgische procedure voor de levering van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen van de ischemische achterbeen is aangetoond, met niet-invasieve tracking door bioluminescentie imaging.
Abstract
Perifeer arterieel vaatlijden (PAD) het gevolg van vernauwing van de perifere slagaders die zuurstofrijk bloed en voedingsstoffen leveren aan de benen en voeten, Dit pathologie veroorzaakt symptomen zoals claudicatio intermittens (pijn bij het lopen), pijnlijke ischemische zweren, of zelfs ledematen bedreigend gangreen. Het wordt algemeen aangenomen dat de vasculaire endotheel, een monolaag van endotheelcellen die de luminale oppervlak van alle bloed-en lymfevaten investeert, een dominante rol speelt in vasculaire homeostase en vasculaire regeneratie. Als gevolg hiervan, op basis van stamcellen regeneratie van het endotheel kan een veelbelovende benadering voor de behandeling van PAD worden.
In deze video, tonen we de transplantatie van embryonale stamcellen (ESC) afkomstige endotheel-cellen voor de behandeling van eenzijdige hindimb ischemie als een model van de PAD, gevolgd door de niet-invasieve volgen van cel homing en overleving van bioluminescentie imaging. De specifieke materialen en procedures voor de levering en cell imaging zal worden beschreven. Dit protocol volgt nog een publicatie in het beschrijven van de inductie van ischemie achterbeen door Niiyama et al. 1.
Protocol
1. Differentiatie van muriene sociaal-economische raden in de endotheelcellen
- Het protocol voor differentiatie SER in de endotheelcellen wordt elders beschreven en is niet de focus van dit protocol 2,3. Kortom, zijn de cellen toegestaan om te differentiëren, en de cellen die positief zijn voor de endotheliale merkers zoals CD31 of vasculaire endotheliale cadherine (VE-cadherine) worden vervolgens gezuiverd door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS).
2. De bouw van de Double Fusion Reporter Gene en Lentivirale transductie
- Bioluminescentie kan worden gebruikt om cellen die zijn aangepast om reporter genen zoals vuurvlieg luciferase (schommelingen) te uiten track. Voor deze toepassing, onze cellen bevatten zowel schommelingen en verbeterde groene fluorescentie eiwit (eGFP) fusie-gen onder de controle van een interne ubiquitine promotor. Om de cellen te wijzigen, het transgen lentivirale vector met de belangrijkste geoptimaliseerd genetische elementen te voldoen aan de bio-veiligheid criteria en een toename van transductie-efficiëntie, kan PFU-FG vector ontwikkeld in ons laboratorium het dragen van de fluc-eGFP fusie reportergen worden gebruikt voor het stabiel transduceren de cellen na differentiatie. Dit fusieconstruct maakt zowel bioluminescentie en fluorescentie volgen van de getransplanteerde cellen. De procedure voor het genereren van virusdeeltjes, transductie en de productie van de gelabelde cellen die uitdrukken reporter genen wordt elders 4 beschreven.
3. Transplantatie van ESC-afgeleide endotheliale cellen aan de ischemische achterbeen
- Begin de procedure door het opstellen van een muis die heeft ondergaan achterbeen ischemie voor stamceltransplantatie. Om dit te doen, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min.
- Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
- Plaats dan het dier in rugligging op de operatietafel en verbind deze met een continue stroom van 1-3% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min.
- Veeg de huid van de achterbeen met drie afwisselende Betadine en alcohol scrubs.
- Nadat de huid is gereinigd, miljoen ESC-afgeleide endotheliale cellen te verkrijgen in 30 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laden van deze cellen in een 28 gauge naald.
- Wanneer de cellen klaar zijn, voorzichtig lift en uitbreiding van het achterbeen beter te visualiseren de locatie van de gastrocnemius spier. Terwijl het been wordt verlengd, steek de naald door de huid in de onderliggende spier. Zorg ervoor dat niet tot op het bot aanpak. Voorzichtig en langzaam injecteren van de 30 pi cel mengsel in de gastrocnemius. Voor intramusculaire injectie, 30 pL ligt dicht bij de grens van het volume dat kan worden geïnjecteerd. Daarom zijn 28-gauge insulinespuiten voorkeur, omdat, in onze ervaring, zij elimineren het verlies van volume in de spuit naalden.
- Na de injectie is voltooid, gaat u terug met de muis om het herstel kooi en het doorlopend volgen totdat wakker. Laat het dier te laten bekomen voor enkele uren en dan met de in vivo bioluminescentie beeldvorming van de getransplanteerde cellen gaan.
4. Bioluminescentie beeldvorming van ESC-afgeleide endotheelcellen in vivo
- De getransplanteerde ESC afgeleide endothelials cellen werden aangepast om zowel de schommelingen en de eGFP fusiegen onder de controle van een interne ubiquitine-promoter uit te drukken. Daarom kan bioluminescentie worden gebruikt om de cellen binnen de ischemische achterbeen track.
- Om te beginnen deze stap zet op de bioluminescentie imaging-systeem en Living Image acquisitie software. Dan initialiseren van de acquisitie systeem en de afmetingen van het gezichtsveld.
- Plaats vervolgens zwart mat papier op de beeldvorming vak achtergrond-uitstoot te absorberen.
- Zodra de beeldvorming doos klaar is, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij zuurstof aan de uitgang van 1L/min. Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
- Verwijder het haar van beide achterpoten met behulp van een elektrisch scheerapparaat als nodig is.
- Injecteer 10 pi van de D-luciferine per gram lichaamsgewicht in het buikvlies. De D-luciferine is voorbereid in gefilterd voorraad oplossingen van 15 mg / ml in PBS.
- Zodra de luciferine wordt geïnjecteerd, plaats het dier in de beeldvorming vak over het zwarte papier in rugligging, aangesloten op een continue stroom van isofluraan.
- Het plaatsen van dieren in beeldvorming box en verbinding maken met isofluraan.
- Start om beelden voor 10 tot 60 seconden te verwerven met het oog op een optimale belichting tijd waarin het beeld niet verzadigd is vast te stellen. Als het beeld verzadigd raakt, vermindering van de belichtingstijd. Als de bioluminescentie signaal is erg zwak, verhoging van de belichtingstijd.
- Using de optimale belichtingstijd, blijven het verwerven van foto's om de 1-3 minuten totdat het signaal bereikt de maximum en dan vervaagt. Wanneer acquisitie is voltooid, sla het bestand op.
- Het analyseren van de gegevens, selecteert u de regio's van belang (ROI) dat de injectieplaats te dekken. Als een negatieve controle, kan een soortgelijke ROI geselecteerd worden voor de niet-geopereerde been. Met behulp van de software, meet de totale uitstraling, die wordt uitgedrukt in eenheden van fotonen / seconden / cm 2 / steradiaal (p / s / cm 2 / sr), voor de ROI voor elk tijdpunt. De maximale waarde moet worden gebruikt in de definitieve gegevens. De gegevens kunnen ook worden geëxporteerd naar Excel-spreadsheet voor toekomstig gebruik.
- Zodra alle gegevens zijn verkregen, terug het dier om het herstel kooi en bewaken continu totdat het dier ontwaakt.
- Herhaal deze procedure om de cellen te volgen in de tijd.
- Op een gewenst tijdstip, kan het dier worden gedood voor de beoordeling van weefsel functie.
5. Representatieve resultaten
Een vertegenwoordiger bioluminescentie beeld van de getransplanteerde cellen in het linker achterbeen ischemische is weergegeven in figuur 1. Tijdens de overname van bioluminescentie, zal de intensiteit toenemen met de tijd, en de maximale waarde die tijdens het tijdsverloop dient te worden gerapporteerd als de uiteindelijke waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sociaal-economische raden zijn een veelbelovende bron cel voor de behandeling van weefsel ischemie vanwege hun plasticiteit van differentiatie en hun vermogen om aanleiding te geven tot cellijnen die alle drie kiembladen, inclusief endotheelcellen. Te overwinnen de ethische bezorgdheid in verband met sociaal-economische raden, kan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) een alternatief zijn pluripotente stamcellen bron dat de ethische bezwaren overwint. Naast de sociaal-economische raden, kunnen volwassen stamcellen, zoals endotheliale progenitor cellen (EPC's) en hematopoietische stamcellen (HSC's) ook worden gebruikt, maar deze celtypen kan beperkt therapeutisch effect hebben bij patiënten met PAD. Intramusculaire levering van cellen is minimaal invasief en eenvoudig uit te voeren, en deze wijze van levering is ook vatbaar voor de levering van oplosbare factoren of plasmiden. Echter, voor een betere toegang van de getransplanteerde cellen aan het vaatstelsel, systemische toediening in de femorale slagader of staartader worden gebruikt in plaats van intramusculaire injecties.
Bioluminescentie imaging biedt het voordeel van het uitvoeren van high-throughput en niet-invasieve volgen van overleving van de cel. In combinatie met functionele testen zoals laser Doppler doorbloeding of histologische analyse van neovascularisatie, kunnen deze technieken bij elkaar kunnen de onderzoekers het therapeutisch effect van celtransplantatie te beoordelen op het herstel van achterbeen ischemie.
Tot slot hebben we aangetoond een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het leveren en het volgen van ESC-afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, en aan de Stanford Small Animal Imaging Core voor technische ondersteuning. De auteurs danken ook AM Bickford, Inc voor ondersteuning van veterinaire apparatuur. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), de Californische tabak Related Disease Research Program van de University of California (15DAT-0257 en 1514RT-0169) , en het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RS1-00183).
NH wordt ondersteund door een beurs van de American Heart Association. kunnen Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P.
- Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).
- Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature. 408, 926-926 (2000).
- De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging. Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).
- Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113, 1005-1114 (2006).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells. J Vis Exp. , (2008).
