Summary
O procedimento cirúrgico para a entrega de células-tronco embrionárias derivadas de células endoteliais para hindlimb isquêmica é demonstrada, com não-invasivo de monitoramento por imagem de bioluminescência.
Abstract
Doença arterial periférica (DAP) resulta de estreitamento das artérias periféricas que fornecem o sangue oxigenado e nutrientes para as pernas e pés, esta patologia provoca sintomas tais como claudicação intermitente (dor com a caminhada), dolorosos ulcerações isquêmicas, ou mesmo gangrena dos membros em risco. Acredita-se geralmente que o endotélio vascular, uma monocamada de células endoteliais que reveste a superfície luminal de todos os vasos sangüíneos e linfáticos, desempenha um papel dominante na homeostase vascular e regeneração vascular. Como resultado, a base de células-tronco a regeneração do endotélio pode ser uma abordagem promissora para o tratamento da PAD.
Neste vídeo, demonstramos o transplante de células-tronco embrionárias (ESC) derivados de células endoteliais para o tratamento da isquemia hindimb unilateral como um modelo de PAD, seguido por não-invasiva de rastreamento de celular homing e sobrevivência por imagem de bioluminescência. Os materiais e procedimentos específicos para entrega de células e de imagem serão descritas. Este protocolo segue a outra publicação, ao descrever a indução de isquemia por hindlimb Niiyama et al 1.
Protocol
1. Diferenciação dos CES murino em células endoteliais
- O protocolo para a diferenciação em células endoteliais CES é descrito em outros lugares e não é o foco deste protocolo 2,3. Resumidamente, as células podem se diferenciar, e as células que são positivas para os marcadores endoteliais, tais como CD31 ou caderina endotelial vascular (VE-caderina) são purificados por separação de células ativadas por fluorescência (FACS).
2. Construção da Double Fusion Gene Reporter e Transdução Lentivirus
- Bioluminescência pode ser usado para rastrear as células que são modificados para expressar genes repórter, como vaga-lume luciferase (flutuações). Para esta aplicação, as nossas células contêm flutuações e aprimorados fluorescência verde da proteína do gene de fusão (EGFP) sob o controle de um promotor interno ubiquitina. , A fim de modificar as células, o vetor de transgene lentiviral contendo a chave otimizado elementos genéticos para cumprir os critérios de biossegurança, bem como a eficiência de transdução de aumento, UFP-FG vector desenvolvidos em nosso laboratório carregando a flutuações de eGFP gene repórter de fusão podem ser usadas para estável transdução de células após a diferenciação. Esta construção de fusão permite tanto a bioluminescência e rastreamento de fluorescência das células transplantadas. O procedimento para a geração de partículas virais, transdução e produção de células marcadas que os genes repórter expressar é descrito em outra parte 4.
3. Transplante de ESC-derivados de células endoteliais ao hindlimb isquêmica
- Iniciar o procedimento, preparando um rato que sofreu isquemia hindlimb para o transplante de células. Para fazer isso, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min.
- Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
- Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal sobre a mesa de operação e conectá-lo a um fluxo contínuo de 1-3% isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min.
- Limpe a pele do membro posterior, com três esfrega alternando betadine e álcool.
- Quando a pele é limpa, obter um milhão ESC derivados de células endoteliais em 30 mL de tampão fosfato (PBS). Carregar essas células em uma agulha de calibre 28.
- Quando as células estão prontos, levante com cuidado e ampliar a hindlimb para melhor visualizar a localização do músculo gastrocnêmio. Enquanto a perna é estendida, insira a agulha através da pele até o músculo subjacente. Tome cuidado para não abordar o osso. Suavemente e injecte lentamente a mistura de células 30 mL para o gastrocnêmio. Por via intramuscular, 30 mL está perto do limite de volume que pode ser injetado. Portanto, calibre 28 seringas de insulina são preferidas porque, em nossa experiência, eles eliminam o volume de perda de agulhas de seringa.
- Após a injeção é completa, devolva o mouse para a gaiola de recuperação e monitorá-lo continuamente até que desperto. Permitir que o animal se recuperar durante várias horas e depois prosseguir com a imagem de bioluminescência vivo das células transplantadas.
4. Imagem de bioluminescência de ESC-derivados de células endoteliais in vivo
- O transplante de células-ESC derivados endothelials foram modificados para expressar tanto flutuações eo gene de fusão eGFP sob o controle de um promotor interno ubiquitina. Portanto, a bioluminescência pode ser usado para rastrear as células dentro do hindlimb isquêmica.
- Para começar esta etapa, ligue o sistema de imagem de bioluminescência e software Vivendo aquisição de imagens. Em seguida, inicializar o sistema de aquisição e especificar as dimensões do campo de visão.
- Em seguida, coloque papel preto fosco para a caixa de imagem para absorver emissões de fundo.
- Uma vez que a caixa de imagem está pronta, coloque o mouse para dentro da câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio na saída de 1l/min. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
- Remover os pêlos de ambos os membros posteriores usando um barbeador elétrico, se necessário.
- Injectar 10 mL de D-luciferina por grama de peso corporal para o peritônio. A D-luciferina é preparado com antecedência em soluções estoque filtrada de 15 mg / mL em PBS.
- Uma vez que a luciferina é injetado, coloque o animal na caixa de imagem sobre o papel preto em decúbito dorsal, ligada a um fluxo contínuo de isoflurano.
- Colocando o animal em caixa de imagem e conexão com isoflurano.
- Começar a adquirir imagens de 10-60 segundos a fim de determinar um tempo de exposição ideal para que a imagem não está saturado. Se a imagem se torna saturado, reduzir o tempo de exposição. Se o sinal de bioluminescência é muito fraco, aumente o tempo de exposição.
- Using o tempo de exposição ideal, continue aquisição de imagens a cada 1-3 minutos até que o sinal atinge o máximo e depois se desvanece. Quando a aquisição estiver concluída, salve o arquivo.
- Para analisar os dados, selecionar regiões de interesse (ROIs) que cobrem o local da injeção. Como controle negativo, um ROI semelhante pode ser selecionado para a perna não-operada. Usando o software, medir o brilho total, que é expressa em unidades de fótons / segundo / cm 2 / esterradiano (p / s / cm 2 / sr), para a ROIs para cada ponto no tempo. O valor máximo deve ser usado nos dados finais. Os dados também podem ser exportados para planilha Excel para uso futuro.
- Uma vez que todos os dados são adquiridos, devolver o animal para a gaiola de recuperação e monitorar continuamente até que o desperta animal.
- Repita este procedimento para rastrear as células ao longo do tempo.
- Em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função do tecido.
5. Resultados representante
Uma imagem de bioluminescência representante de células transplantadas na hindlimb deixou isquêmica é mostrado na Figura 1. Durante a aquisição de bioluminescência, a intensidade vai aumentar com o tempo, eo valor máximo obtido durante o curso do tempo deve ser relatado como o valor final.
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Discussion
CES são uma fonte de células promissora para o tratamento da isquemia tecidual devido à sua plasticidade de diferenciação e sua capacidade de dar origem a linhagens de células compreendendo todas as três camadas germinativas, incluindo células endoteliais. Para superar as preocupações éticas associadas com os CES, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) pode ser uma alternativa de células-tronco pluripotentes fonte que supera as preocupações éticas. Além CES, as células-tronco adultas, como as células progenitoras endoteliais (EPCs) e células-tronco hematopoéticas (HSCs) também podem ser usados, mas estes tipos de células podem ter efeito terapêutico limitado em pacientes com DAP. Entrega intramuscular de células é minimamente invasivo e fácil de realizar, e este tipo de parto também é propícia para a entrega de fatores solúveis ou plasmídeos. No entanto, para facilitar o acesso das células transplantadas para a entrega, vasculatura sistêmica na artéria femoral ou veia da cauda pode ser usado em vez de injeções intramusculares.
Imagem de bioluminescência oferece a vantagem de realizar rastreamento de alto rendimento e não-invasivo de sobrevivência da célula. Quando combinado com os ensaios funcionais, tais como laser Doppler perfusão sanguínea ou análise histológica de neovascularização, essas técnicas em conjunto pode permitir aos pesquisadores avaliar o efeito terapêutico do transplante de células na recuperação de isquemia hindlimb.
Em conclusão, nós demonstramos um método simples e reprodutível para a entrega e acompanhamento de ESC-derivados de células endoteliais para o tratamento da isquemia dos membros posteriores.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, e Stanford Núcleo de Imagem de Pequenos Animais para assistência técnica. Os autores também agradecem AM Bickford, Inc. para suporte de equipamentos veterinários. Esta pesquisa foi suportada por concessões de pesquisa do National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), o Programa de Pesquisa do Tabaco Califórnia Related Disease da Universidade da Califórnia (15IT-0257 e 1514RT-0169) , e do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RS1-00183).
NH é apoiado por uma bolsa da American Heart Association. pode Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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