Summary
胚性幹細胞の配信のための外科的処置は、虚血後肢への細胞由来の内皮細胞は、生物発光イメージングによる非侵襲的な追跡と、示されている。
Abstract
脚と足に酸素化血液と栄養分を供給する末梢動脈の狭窄から末梢動脈疾患（PAD）の結果は、この病理は、このような間欠性跛行（歩くと痛み）、痛みを伴う虚血性潰瘍、あるいは四肢を脅かす壊疽などの症状を引き起こします。これは、一般的に血管内皮、すべての血液やリンパ管の管腔表面を投資する内皮細胞の単層は、血管の恒常性と血管再生で主要な役割を果たしていると考えられている。その結果、内皮細胞の幹細胞ベースの再生には、PADを治療するための有望なアプローチがあります。
このビデオでは、我々は胚性幹細胞（ESC）由来の生物発光イメージングによるホーミング細胞と生存の非侵襲的な追跡が続くPADのモデルとして一方的hindimbの虚血の治療のための内皮細胞の移植を示しています。細胞送達およびイメージングのための特定の材料および手順について説明する。このプロトコルは、新山らによる後肢虚血の誘導を記述する別のパブリケーションに従います。1
Protocol
1。内皮細胞へのマウスES細胞の分化
- 内皮細胞にES細胞を区別するためのプロトコルは別の場所で記述し、このプロトコル2,3の焦点ではありません。簡単に言えば、細胞は区別するために許可され、そしてそのようなCD31または血管内皮カドヘリン（VE -カドヘリン）のような内皮細胞マーカー陽性の細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製されています。
2。ダブル融合レポーター遺伝子とレンチウイルス形質導入の建設
- 生物発光は、ホタルルシフェラーゼ（変動を確認）などのレポーター遺伝子を発現するように変更されている細胞を追跡するために使用することができます。このアプリケーションでは、我々の細胞は内部のユビキチンプロモーターの制御下に両方の変動を確認し、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）融合遺伝子が含まれています。セルを変更するために、バイオセーフティ基準と同様に増加した形質導入効率を達成するために重要な最適化された遺伝的要素を含むトランスジーンレンチウイルスベクターは、変動を確認- EGFP融合レポーター遺伝子を運ぶ私たちの研究室で開発PFU - FGのベクトルが安定するために使用することができます。分化後の細胞を伝達する。この融合構築物は、移植細胞の生物発光と蛍光の追跡の両方が有効になります。レポーター遺伝子を発現する標識された細胞のウイルス粒子、伝達し、生産を生成するための手順は、他の4説明されています。
3。虚血後肢にESC -由来の内皮細胞の移植
- 細胞移植のための後肢虚血を受けているマウスを用意することで手順を開始します。これを行うには、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。
- それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。
- その後、手術台の上に仰臥位に動物を配置し、1L/minの流量で100％酸素でイソフルラン1〜3％連続流に接続してください。
- three交互betadineとアルコールスクラブと後肢の皮膚を拭いてください。
- 肌がきれいにされると、（PBS）リン酸緩衝生理食塩水の30μLを、100万ESC -由来の内皮細胞を得る。 28ゲージの針に、これらの細胞をロードする。
- 細胞の準備が整うと、静かに持ち上げて、より良い腓腹筋の場所を視覚化するために後肢を拡張。足が拡張されている間、基本的な筋肉に皮膚を通して針を挿入する。骨に接近しないように注意してください。静かにゆっくりと腓腹筋に30μLの細胞混合物を注入する。筋肉内注射の場合、30μLの注入可能な量の限界に近いです。我々の経験で、彼らは注射針での損失量を排除する、それ故、28ゲージのインスリン注射が好ましい。
- 注入が完了すると、回復のケージにマウスを返し、目を覚ましになるまで継続的に監視する。動物は、数時間で回復し、移植細胞のin vivo生物発光イメージングを続行することができます。
4。 in vivoでのESC -由来の内皮細胞の生物発光イメージング
- 移植ESC由来endothelials細胞は内部のユビキチンプロモーターの制御下で変動を確認し、EGFPの融合遺伝子の両方を発現するように変更されました。従って、生物発光は、虚血後肢内の細胞を追跡するために使用することができます。
- このステップを開始するには、生物発光イメージングシステムとリビングの画像取得ソフトウエアをオンにします。その後、収集システムを初期化し、視野の大きさを指定します。
- 背景放射を吸収するために、イメージングボックスの上に横に、場所黒のマット紙。
- イメージングボックスの準備が整ったら、1L/minの出力で酸素のイソフルラン1〜3％を含む麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。それは外的刺激に反応しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残す。その後、誘導室から動物を削除します。
- 必要に応じて電気カミソリを使用して、両方の後肢から毛を取り除く。
- 腹膜に体重1g当たり、D -ルシフェリンの10μLを注入する。 D -ルシフェリンをPBS中の15 mg / mLのフィルタリングストック溶液に予め用意されています。
- ルシフェリンが注入されると、イソフルランの連続的な流れに接続して仰臥位で、黒い紙、上の画像ボックスに動物を配置。
- イメージングボックスに動物を配置し、イソフルランに接続する。
- 画像が飽和されていない最適な露光時間を決定するために、10〜60秒のために画像を取得するために始める。画像が飽和状態になった場合、露光時間を減らす。生物発光シグナルは非常に弱い場合は、露出時間を増やします。
- Usinグラム最適な露光時間は、信号が最大としてフェードに達するまで毎に1-3分の画像を取得し続けます。買収が完了したら、ファイルを保存します。
- データを分析するために、注射部位をカバーする観測領域（ROI）を選択します。ネガティブコントロールとして、同様のROIは、非手術足のために選択することができます。ソフトウェアを使用して、各時点に対してROIのための光子/秒/ cm 2で /ステラジアン（P / S / cm 2で / SR）の単位で表現されている合計の輝きを、測定する。最大値は、最終的なデータで使用する必要があります。データはまた、将来の使用のためのExcelスプレッドシートにエクスポートすることができます。
- 一度すべてのデータが取得されている、回復のケージに動物を戻すと、動物の目を覚ましまで継続的に監視する。
- 時間をかけて細胞を追跡するために、この手順を繰り返します。
- 希望する時点で、動物は、組織機能の評価のために安楽死することができます。
5。代表的な結果
左の虚血後肢における移植細胞の代表的な生物発光画像を図1に示されています。生物発光の買収時には、強度は時間とともに増加し、時間の経過中に得られた最大値を最終値として報告されるべきである。
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Discussion
ESCは、ために分化し、血管内皮細胞を含むすべての3つの胚芽層を、前記の細胞系譜を生じさせる能力の彼らの可塑性の組織の虚血の治療において有望な細胞源です。 ES細胞に関連する倫理的な問題を克服するために、誘導多能性幹細胞（性IPSC）倫理的な問題を克服する代替の多能性幹細胞の源とすることができる。 ESCのほかに、そのような内皮前駆細胞（EPC）と造血幹細胞（HSC）のような成体幹細胞を使用することもできますが、これらの細胞型は、PAD患者で治療効果を制限している可能性があります。細胞の筋肉内送達は、低侵襲と実行が容易であり、配信のこのモードは、可溶性因子またはプラスミドの配信に適している。しかし、大腿動脈または尾静脈に血管系、全身送達に移植された細胞のアクセスを容易にするために筋肉内注射の代わりに使用することができます。
生物発光イメージングは、細胞の生存率の高スループットと非侵襲的な追跡を行うことの利点を提供しています。このようなレーザードップラー血流や血管新生の組織学的分析としての機能アッセイと組み合わせることで、一緒にこれらの技術は、研究者は後肢虚血の回復に細胞移植の治療効果を評価できるようにすることができます。
結論として、我々は、後肢虚血の治療のためにESC -由来の内皮細胞を提供し、追跡するためのシンプルで再現性のある方法を示している。
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Acknowledgments
著者はアンドレアアクステル聡伊藤、MD、ジェフVelotta、MD、グラントホイト、ロバートC.ロビンス、MD、金玉、MD、ティムドイル博士、および技術支援のためのスタンフォード大学小動物のイメージングコアを感謝。また、作者は獣医機器のサポートのためにAMビックフォード社に感謝。この研究は国立衛生研究所（R01 HL - 75774、R01 CA098303、R21 HL085743、1K12 HL087746）、カリフォルニア大学のカリフォルニア州のたばこ関連病研究プログラム（15IT - 0257と1514RT - 0169）からの研究補助金によって支えられて、および再生医療（RS1 - 00183）のためのカリフォルニア工科大学。
NHは、アメリカ心臓協会からのフェローシップでサポートされています。心臓協会ができます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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