/ प्रकाश अंधेरे चूहे के लिए संक्रमण टेस्ट

Summary

संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने के लिए चूहों में व्यवहार की तरह चिंता को मापने के लिए परीक्षण के है. यहाँ, हम एक फिल्म है कि कैसे हम परीक्षण आचरण पर विस्तृत प्रक्रिया से पता चलता है वर्तमान.

Abstract

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

Protocol

संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया उपकरण (21x42x25 सेमी) पिंजरे दरवाजे के साथ एक विभाजन (Ohara एंड कं, टोक्यो) के द्वारा बराबर आकार के दो वर्गों में विभाजित शामिल है. चूहे विज्ञापन libitum भोजन और पानी के लिए उपयोग के साथ एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र (7:00 AM पर रोशनी) के साथ एक कमरे में तीन पिंजरे प्रति चार रखे जाते हैं. आदर्श रूप में, एक साथ दो नियंत्रण और दो म्यूटेंट रखे जाते हैं के रूप में जल्द ही के रूप में वे दूध छुड़ाने का वायु के समय genotyped हैं चूहों पुनः आयोजन करके. व्यवहार परीक्षण 9:00 के बीच किया जाता है AM और 6:00 सभी चूहों युक्त पिंजरों व्यवहार परीक्षण कमरे में 30 मिनट स्थानांतरित कर रहे हैं पहले परीक्षण से पहले शुरू होता है. एक कक्ष चमकीले सफेद डायोड (लक्स 390) के द्वारा प्रबुद्ध है, जबकि अन्य कक्ष (लक्स 2) अंधेरा है. चूहे अंधेरे पक्ष में रखा जाता है और दरवाजा 3 स्वतः सेकंड खोला बाद माउस अवरक्त कैमरे द्वारा पता चला है. दरवाजा इतना प्रयोग किया जाता है कि चूहों प्रकाश चैम्बर तुरंत प्रवेश नहीं करते हैं उनके experimenter से बचने की प्रेरणा के साथ रिलीज के बाद, के बाद से प्रकाश कक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता चिंता की तरह व्यवहार के एक सूचकांक के रूप में सेवा कर सकता है. चूहे के लिए 10 मिनट के लिए खुले दरवाजे के साथ दो कोठरियों के बीच आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी जाती है है. व्यवहार डेटा (LD4 छवि) प्राप्त करने और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया आवेदन सार्वजनिक डोमेन छवि जम्मू कार्यक्रम (मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान में byWayne Rasband विकसित और http://rsb.info.nih.gov/ij पर उपलब्ध पर आधारित है /) है, जो Tsuyoshi Miyakawa (O'Hara एंड कं, टोक्यो, जापान के माध्यम से उपलब्ध है) के द्वारा संशोधित किया गया था. दूरी कूच, प्रत्येक कक्ष में संक्रमण की कुल संख्या, कक्ष प्रत्येक में बिताए समय, और प्रकाश छवि LD4 प्रोग्राम द्वारा दर्ज chamberare दर्ज विलंबता. प्रत्येक परीक्षण के बाद, सभी कक्षों सुपर hypochlorous पानी से साफ कर रहे हैं के लिए एक घ्राण cues के आधार पर पूर्वाग्रह को रोकने के.

Discussion

हालांकि माउस जीनोम अनुक्रम के सभी निर्धारित किया गया है, इन जीनों के अधिकांश के कार्य नहीं जाना जाता है. जीन लक्ष्यीकरण तकनीकों, तथापि, चूहों में एक विशेष जीन (; ऑस्टिन एट अल, 2004. Aiba एट अल, 2007) को हटाने या हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्परिवर्ती चूहों के व्यवहार विश्लेषण (; Takao एट अल, 2007 Takao और Miyakawa, 2006) द्वारा आयोजित एक विशिष्ट व्यवहार पर किसी जीन के प्रभाव तो निर्धारित किया जा सकता है. उत्परिवर्ती चूहों के व्यवहार phenotyping के लिए एक परीक्षण के रूप में, संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने के लिए चूहों में व्यवहार (Crawley, 2000) की तरह चिंता को मापने के लिए परीक्षण के है. परीक्षण चूहों के प्राकृतिक चमकीले प्रबुद्ध क्षेत्रों के लिए घृणा और अपने उपन्यास के वातावरण में सहज खोजपूर्ण व्यवहार (Crawley, 1985) पर आधारित है. परीक्षण anxiolytic दवा इलाज (Crawley, 1985) के प्रति संवेदनशील है. तंत्र एक अंधेरे कक्ष और एक चमकीले प्रबुद्ध कक्ष के होते हैं. एक प्रतिबंधित खोलने, 3 सेमी उच्च, 5 सेमी चौड़ा द्वारा दो कक्षों को जोड़ता है. चूहे दो कोठरियों के बीच आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी जाती है है. उज्ज्वल चेंबर में प्रविष्टियों की संख्या और समय की अवधि के खर्च उज्ज्वल अंतरिक्ष चूहों में चिंता का सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है.

संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण मूल Crawley और सहयोगियों (Crawley और गुडविन, 1980) द्वारा विकसित किया गया था. उनके मूल संस्करण और हमारे परीक्षण के बीच दो मतभेद हैं. सबसे पहले, प्रकाश चैम्बर मूल संस्करण में अंधेरे कक्ष से बड़ा है, जबकि दो कक्षों का आकार परीक्षण के हमारे संस्करण में ही है. दूसरा, मूल संस्करण में, प्रकाश चैम्बर कोई छत नहीं थी और पारदर्शी प्रकाश कक्ष की दीवारों (Crawley और गुडविन, 1980) थे, जबकि हम प्रकाश कक्ष की छत और दीवारों के लिए अपारदर्शी सफेद प्लास्टिक का उपयोग करें. इन मतभेदों को, अर्थात् आकार और प्रकाश चैम्बर के खुलेपन, उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता के साथ – साथ पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण के मूल संस्करण में चिंता खुले अंतरिक्ष के लिए अनुमति देते हैं. हमारी प्रयोगशाला में, तथापि, खुले अंतरिक्ष चूहों में व्यवहार की तरह चिंता एक ऊंचा प्लस भूलभुलैया में परीक्षण किया है. दीवारों और छत अपारदर्शी, प्रकाश चैम्बर के आकार, और हमारे विशिष्ट / प्रकाश अंधेरे संक्रमण परीक्षण प्रोटोकॉल मूल संस्करण की तुलना में उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता का पता लगाने के लिए विशेष है.

हालांकि संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण और ऊंचा भूलभुलैया प्लस दोनों तरह व्यवहार चिंता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, परिणाम हमेशा अनुरूप नहीं हैं. उदाहरण के लिए, अग्रमस्तिष्क विशेष calcineurin पीटा चूहों संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण में प्रकाश के चैम्बर में समय की एक कम राशि खर्च करते हैं, लेकिन ऊंचा प्लस भूलभुलैया में खुले हाथों में समय की वृद्धि हुई राशि (Miyakawa एट अल, 2003) . हम धारणा है कि हमारे प्रकाश / अंधेरे संक्रमण परीक्षण और ऊंचा प्लस भूलभुलैया परीक्षण चिंता की तरह व्यवहार के विभिन्न पहलुओं का आकलन जैसे उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता और खुली जगह चिंता की तरह व्यवहार. इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम एक बड़ा सेट दोनों परीक्षणों में एक ही चूहों का उपयोग कर एकत्र आंकड़ों का इस्तेमाल किया. हमारी प्रयोगशाला में, हम व्यवहार परीक्षण जीन के व्यवहार महत्व के लिए स्क्रीन करने के लिए कई डोमेन कवर बैटरी आचरण. परीक्षण बैटरी को पूरा करने के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता है. परीक्षण अवधि के दौरान, माउस पिंजरों हमारे सुविधा में एक रैक पर रखा जाता है. यदि चूहों अन्य संस्थानों से हमारी प्रयोगशाला में ले जाया जाता है, वे कम से कम 1 सप्ताह के लिए हमारी सुविधा के पर्यावरण के लिए आदत कर रहे हैं. Habituation अवधि के बाद, चूहों एक सामान्य स्वास्थ्य जांच और स्क्रीनिंग neurologic (Miyakawa एट अल. 2003) के अधीन हैं, और इन सरल परीक्षाओं के बाद, चूहों संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण करने के लिए अधीन हैं. परीक्षण habituation की प्रयोगात्मक कमरे में 30 मिनट के बाद एक ध्वनि सबूत प्रयोगात्मक कमरे में आयोजित किया जाता है, के रूप में फिल्म में दिखाया गया है.

हम अनुवांशिक इंजीनियर उत्परिवर्ती फिल्म में दिखाया गया है प्रोटोकॉल का उपयोग चूहों के 60 से अधिक उपभेदों का आकलन किया है और 3000 से अधिक चूहों (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों सहित) के लिए कच्चे डेटा का एक बड़ा सेट है. हम कारक विश्लेषण का आयोजन करने के लिए कच्चे डेटा के बड़े सेट का लाभ ले लो. दरअसल, हम प्रत्येक परीक्षण (अप्रकाशित डेटा) से विभिन्न कारकों का पता चला, यद्यपि वहाँ सूचकांक (अप्रकाशित डेटा) के बीच कुछ महत्वपूर्ण सहसंबंध थे .. उन डेटा एक सार्वजनिक डेटाबेस है कि अब हम निर्माण कर रहे हैं के हिस्से के रूप में बताया जाएगा.

हमारे परीक्षण बैटरी, जंगली प्रकार littermates के आम तौर पर एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. एक पृष्ठभूमि तनाव के रूप में, C57BL/6J चूहों आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है है. हम C57BL/6J परीक्षण बैटरी में उत्परिवर्ती चूहों के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल चूहों के डेटा एकत्र. C57BL/6J हमारे संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण में चूहों से प्राप्त सूचकांक के रूप में इस प्रकार थे (n = 795; मतलब SEM), दूरी कूच: प्रकाश के चैम्बर में 846.5 8.88 सेमी 1478.5 अंधेरे कक्ष में 9.53 सेमी, समय की अवधि खर्च 215.8 प्रकाश में 1.85 है, अंधेरे में 395.8 1.86 एस; डिब्बों के बीच संक्रमण के संख्या: 30.52 .43, प्रकाश कक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता: 64.94 2.40 एस कक्षों के लिए प्रवेश द्वार के आसपास चूहों के आंदोलन कैमरा से पता चला है और दोनों ग में बिताए समय के रूप में गिना हैhambers. इस वजह से प्रकाश में समय का मतलब अवधि की राशि खर्च और है कि अंधेरे डिब्बों में परीक्षण (600 s) की पूरी अवधि के तुलना में अधिक था.

हमारे प्रोटोकॉल में, एक माउस पहले अंधेरे कक्ष में रखा गया है. अंधेरे कक्ष में माउस रखने के बाद तीन सेकंड कोठरियों के बीच दरवाजा स्वचालित रूप से खुलता है और माउस स्वतंत्र रूप से दो कोठरियों के बीच ले जा सकते हैं. 215.8 एस 1.85, अंधेरे में बिताए समय की अवधि: 316.3 2.11 एस [समय अंधेरे में खर्च करता है C57BL/6J चूहों प्रकाश के चैम्बर में अंधेरे कक्ष में की तुलना में कम समय (पी <.0001, अवधि है अगर समय प्रकाश में खर्च खर्च प्रारंभिक समय पहले अंधेरे में खर्च के लिए पहली बार के लिए प्रकाश], n 795 = बनती टी) परीक्षा कक्ष में प्रवेश कर शामिल नहीं है. यह इंगित करता है कि C57BL/6J चूहों प्रकाश चैम्बर से बचने के प्रयास करते हैं, और समय प्रकाश में खर्च चिंता की तरह व्यवहार का एक अच्छा सूचकांक है कि.

उत्परिवर्ती चूहों के विभिन्न प्रकारों से प्राप्त परिणामों को आसानी से तुलना कर रहे हैं क्योंकि सभी डेटा एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. उत्परिवर्ती चूहों की एक नस्ल है कि आसानी से और reproduced किया जा सकता है अन्य म्यूटेंट के डेटा के साथ तुलना की phenotyping परिणाम प्राप्त करने के लिए, व्यवहार परीक्षण तरीकों के रूप में प्रयोगशालाओं के बीच संभव के रूप में समान होना चाहिए. Crabbe और उनके सहयोगियों माउस व्यवहार और प्रयोगशाला वातावरण बिल्कुल ही सहज उपभेदों और एक अशक्त उत्परिवर्ती तनाव का उपयोग कर के बीच बातचीत का परीक्षण किया. उनके अध्ययन में, तंत्र, परीक्षण प्रोटोकॉल, और कई पर्यावरण चर कड़ाई से मानकीकृत थे. मानकीकरण के बावजूद, वे प्रयोगशालाओं भर में व्यवहार में व्यवस्थित अंतर पाया गया, हालांकि वे भी सभी व्यवहार (Crabbe एट अल., 1999) में तनाव मतभेदों का पता चला. उन्होंने बताया कि बेकाबू चर और प्रयोगों म्यूटेंट निस्र्पक के परिणाम उपज सकता है कि एक विशेष प्रयोगशाला के लिए विशेष स्वभाव हैं. प्रक्रियात्मक मतभेद है कि प्रयोगशालाओं के बीच मौजूद हैं यह मुश्किल को दोहराने या प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करते हैं. यहाँ, हम प्रकाश / अंधेरे तो एक फिल्म है कि प्रोटोकॉल का विवरण प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में संक्रमण के परीक्षण के लिए हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित थे.

प्रोटोकॉल के दृश्य प्रलेखन स्थापना प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के विवरण के बेहतर समझ की सुविधा प्रयोगशालाओं के पार और उत्परिवर्ती चूहों के विभिन्न प्रकारों का व्यवहार phenotypes की तुलना के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए अनुमति देता है इस परीक्षण का उपयोग का आकलन किया. अधिक ऊंचा भूलभुलैया, खुले मैदान परीक्षण, porsolt मजबूर तैरना परीक्षण, भय कंडीशनिंग, है कि हम हमारे व्यवहार परीक्षण बैटरी में प्रयोग के लिए जैसे अन्य प्रोटोकॉल, सिनेमा वर्तमान में भविष्य वीडियो पत्रिका लेख के रूप में प्रकाशन के लिए किए जा रहे हैं.