Summary
マイクロコンタクトプリンティングは、材料の表面にパターンの蛋白質と他の分子に広く使用されています。我々は、ガラス上にフィブロネクチンのパターンをスタンプする、このプロセスの基本的な手順を示します。
Abstract
基板上へのパターンのタンパク質やその他の生体分子への能力は、細胞外環境の空間的な複雑さを捕捉するために重要です。ホワイトサイズグループによるマイクロコンタクトプリンティングの開発（
Protocol
1。ソリューションと材料の準備
これらの手順は、事前に数日間行ってください。
- ガラス製カバースリップ。透明になるまで、攪拌しながら、3比及び加熱：水1で混合：カバーグラスはLinbro 7Xの洗剤の溶液中に10分間浸漬することにより洗浄した。カバースリップを脱イオン水で広範に洗浄し、その後6時間450℃で焼成した。セラミック染色ラックにカバースリップをロードすると（試薬を参照）、このプロセスを簡素化。
- スタンピングのためのタンパク質溶液。 1 mg / mLの濃度のストック溶液にメーカーの指示に従って再構成のフィブロネクチン。
2。トポロジカルマスターからスタンプをキャスト
これらの手順は、事前に数日間実施することができます。組織培養皿のようなカバー料理の店のスタンプパターンアップ、。
- 圧縮、フィルタリングされた空気または不活性ガスの流れを使用してマスターから緩んでほこりを取り除きます。
- マスターよりちょうど大きいプラスチック皿の底に、マスター、パターン化された面を上に置きます。 60 - または100 - mm組織培養皿は、この目的に適しています。
- 10重量：1のエラストマーベース：ポリスチレン50 ml遠心チューブに、硬化剤の割合でSylgardコンポーネントを組み合わせる。使い捨てピペットのようなプラスチック製のデバイスを、使用して充分に混合する。皿の面積の平方センチメートル当たりエラストマーの少なくとも0.2 mlを調製。
- 気泡を除去するために5分間300gで50 mlチューブを遠心します。
- マスター以上のエラストマーを注ぎ、その後30分間、真空下で、デシケーターに入れてください。
- 65℃以上で2時間オーブンでエラストマーを治す。より高い温度でと硬めのエラストマーで長い時間の結果を得るために硬化。室温に冷ます。
- マスターからの切手のシートを区切ります。
3。ガラス上にフィブロネクチンのマイクロコンタクトプリンティング
- 単一のタイムスタンプを切り取ります。 X 1エリア内のCMと1 cmに4ミリメートルX 4 mmの切手 - 厚さ2mmから始めるのが最も簡単である。スライドガラスまたはプラスチック製の小さな皿の上に置いてパターンのある面を上に。
- 30秒間、真空下で、プラズマクリーナー、およびプロセスにスタンプを置きます。その最高出力の設定のままHarrick科学プラズマクリーナーは（装置を参照）、PDMS表面を親水性にレンダリングされます。エラストマーのクラッキングに長い時間の結果。
- 脱イオン水で50μg/ mlののプレス濃度にフィブロネクチン希薄溶液。
- スタンプのソリューションをスタンプの - 小さな滴（50μlの10）を置きます。それは、親水性の表面全体に行き渡ります。ドロップは、スタンプをカバーするが、エッジ上で実行されないことだけ十分な解決策を追加。 5分間スタンプするタンパク質の吸着をしてみましょう。
- キムワイプ®またはその他のクリーンペーパーのティッシュを使用して、パターン化された領域を触れることなく、タイムスタンプからタンパク質溶液のほとんどをオフに放出する。
- 窒素のようなきれいな、乾燥した、不活性ガスの気流下でスタンプから残りの溶液を乾燥させる。
- ピンセットを使用して、ガラススライド、反転、および洗浄したガラスのカバースリップ（表面をパターン化する）と接触している場所からスタンプを削除します。良好な接触を促進する上に重量を配置。 5gの重さで始まり、プレス加工の間の調整、最適なパターニングを提供する特定の重量は、スタンプのサイズとパターンに依存しています。 1分のための表面に接触してスタンプにしておきます。
- 慎重にスタックを分解し、カバースリップとは別のタイムスタンプ。
- 精力的に表面に吸着されていないタンパク質を除去するために、脱イオン水に続いてPBSでパターン化されたカバースリップを、すすいでください。窒素気流下で乾燥したカバースリップ。
代表的な結果
マイクロコンタクトプリンティングは、表面のパターニングの分子のための強力なプロセスです。図で、このプロセスは数十μmから数百ナノメートルに至るまでの寸法を持つフィーチャを作成する機能を持っています。緑色の斑点が図に示されている間、1A、左のロゴは、高さ各200μmです。図1Bは、直径1μmですと4μmの間隔で、測定中心から中心までの間隔で。図。図1Bは、また、添加剤のプロセスであるとすること、すなわち、マイクロコンタクトプリンティングの強力なプロパティを示しています。マイクロコンタクトプリンティングの複数のラウンドは、多成分系3を作成するための単一の表面に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
マイクロコンタクトプリンティングのプロセスは、パターニング基板のさまざまな分子の広い範囲をに適用されたこと、概念的に単純で非常に堅牢です。しかし、このプロセスはアートのようなもののまま。特定の作成されるパターンの形状、パターン化される蛋白質、適用される重量、およびコーティング/プレス条件は、すべてのスタンプ品質に影響を与えます。たとえば、しばしば大規模な機能を、図の右上ロゴに見られるようにパターンのギャップの結果に適用さすぎて少し体重、。 1A。逆に、あまり体重はプラズマ処理のステップが省略されている場合は、2番目の例で、特定のタンパク質（抗体など）より忠実にパターンをfeatures.Asパターニング間の領域におけるタンパク質の意図しない堆積の結果として、タイムスタンプのたるみと崩壊の原因となります、親水性PDMSを残して。ガラス上にフィブロネクチンのスタンプは、このプロセスの基本的なテクニックを示す、このような修正や最適化の出発点としてここに提示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
