Summary
Microcontact baskı malzemesi yüzeylerde desen proteinleri ve diğer molekülleri yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Biz fibronektin cam üzerine desen damgalama, bu sürecin temel adımları göstermektedir.
Abstract
Desen proteinleri ve diğer substratlar üzerine biyomoleküllerin yeteneği ekstrasellüler çevre mekansal karmaşıklığı yakalamak için önemlidir. Whitesides grup tarafından microcontact baskı Gelişimi (
Protocol
1. Çözümler ve malzemelerin hazırlanması
Bu adımlar, birkaç gün önceden yapılmalıdır.
- Cam lamelleri. Temizleyene kadar karıştırarak ile, 3 oranı ve ısıtmalı su, 1 karışık: lameller Linbro 7X deterjan bir çözüm olarak 10 dakika boyunca daldırma tarafından temizlendi. Lameller yoğun deiyonize su ile durulanır ve sonra 6 saat boyunca 450 ° C'de pişirilir. (Reaktifler) seramik boyama rafları lamelleri Yükleniyor bu süreci basitleştirilmiş.
- Protein damgalama için çözüm. 1 mg / ml konsantrasyonu bir stok çözüm üretici talimatlarına sulandırın fibronektin.
2. Topolojik ustadan pulları Oyuncular
Bu adımlar, birkaç gün önceden yapılabilir. Böyle bir doku kültürü yemek olarak kapalı bir çanak Mağaza pulları desen,.
- Ustadan sıkıştırılmış, filtre edilmiş hava veya inert gaz akışı kullanarak gevşek toz çıkarın.
- Sadece master daha büyük bir plastik çanak alt, ana, desenli yan yerleştirin. 60 - ya da 100 mm doku kültürü yemekleri de bu amaç için uygundur.
- Polistiren 50 ml santrifüj tüpüne, sertleştirici oranında Sylgard bileşenleri bir araya getirir: 1: 10 elastomer tabanı kilo. Böyle bir pipet gibi, plastik bir cihaz kullanarak iyice karıştırın. Elastomer çanak alanının santimetre kare başına en az 0.2 ml hazırlayın.
- Hava kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika boyunca 300 G 50 ml tüp santrifüjleyin.
- Elastomer master üzerine dökün, sonra 30 dakika süreyle vakum altında bir desikatöre yerde.
- 65 ° C'de en az 2 saat süreyle bir fırında elastomer Cure. Yüksek sıcaklıklarda ve daha sert elastomer uzun zamanlar sonuçları Kür. Oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- Ana sayfa pullarının ayırın.
3. Camına fibronektin Microcontact baskı
- Tek bir damga kesin. 4 mm uzunluğunda Pullar X 4 mm X 1 cm alanda ve 1 - 2 mm kalınlığında 1 cm ile başlamak daha kolay olacaktır. Bir cam slayt veya küçük plastik tabak koyun desen yüzü yukarı.
- 30 saniye boyunca, vakum altında, bir plazma temizleyici, ve süreç damga yerleştirin. En yüksek çıkış ayarı harrick Bilimsel plazma temizleyici (Ekipman), PDMS yüzeyi hidrofilik verecek. Elastomer çatlama kat daha uzun.
- 50 mcg / ml deiyonize su ile bir damgalama konsantrasyonu fibronektin çözüm sulandırınız.
- Çözümü damga damgalama küçük bir damla (50 ul 10) yerleştirin. Hidrofilik yüzeye yayılmış. Damla damga kapsar, ancak kenarları üzerinde çalışmaz, sadece yeterli bir çözüm ekleyin. 5 dakika damga protein adsorbe edelim.
- Kimwipe ® veya diğer temiz bir kağıt mendil kullanarak, desenli bölgeye dokunmadan, damga protein solüsyonu en fitil.
- Kuru, temiz, kuru, böyle bir azot gibi inert gaz, bir dere altında damga kalan çözüm.
- Cımbız kullanarak, cam slayt damga kaldırmak ters ve temizlenmiş cam lamel (yüzeyi desenli) ile temas yer. Iyi temas teşvik etmek üstüne bir ağırlık koyun. Iyi desenlendirme sağlar özgül ağırlık damga boyut ve desen bağlıdır; 5 gr ağırlığı ile başlar, ve HARDWARE arasında ayarlayın. 1 dakika yüzey ile temas halinde damga bırakın.
- Dikkatli bir yığın sökmeye ve lamel ayrı bir damga.
- Şiddetle yüzeye adsorbe değildir protein kaldırmak için deiyonize su ile PBS içinde desenli lamel, durulayın. Kuru bir azot akışı altında lamel.
Temsilcisi Sonuçlar
Microcontact baskı yüzeylerde desenlendirme moleküller için güçlü bir süreçtir. Bu süreç, Şekil mikrometre onlarca yüzlerce nanometre arasında değişen boyutları ile özellikleri oluşturmak için yeteneğine sahiptir. Yeşil noktalar ise Şekil gösterildiği 1A, soldaki logolar, her yüksekliği 200 mm. 1B, çapı 1 mm ve merkez-merkez ölçülen 4 mikron aralıklarla aralıklı. Şekil 1B, aynı zamanda, güçlü olduğunu microcontact baskı, yani mülkiyet, ve katkı süreci göstermektedir. Microcontact baskı birden fazla mermi, çok bileşenli sistemler 3 oluşturmak için tek bir yüzeye uygulanabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microcontact baskı işlemi desenlendirme moleküllerin geniş bir yelpazede çeşitli yüzeylere uygulanabilir olan, kavramsal olarak basit ve çok sağlam. Ancak bu süreç, bir sanat bir şey kalır. Desen oluşturulacak özel geometri, protein desenli, uygulanan ağırlık ve kaplama / damgalama koşulları damgalama kalitesini etkileyebilir. Örneğin, sık sık büyük özellikleri, desen Şekil sağ üst logosu görülebileceği gibi boşlukları sonuçları uygulanan çok az ağırlık,. 1A. Tersine, çok fazla kilo plazma tedavisi adım atlanmış ise ikinci bir örnek, özel proteinleri (antikorlar gibi) daha iyi bir sadakat ile desen features.As desenli arasındaki bölgelerde istenmeyen protein birikimi ile sonuçlanan, damga sarkma ve çöküşüne sebep olur. PDMS hidrofilik bırakarak. Camına fibronektin damgalama, bu sürecin temel teknikleri gösteren, söz konusu değişiklik ve iyileştirmelerin için bir başlangıç noktası olarak sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
