Summary
הדפסה Microcontact נעשה שימוש נרחב על חלבונים ומולקולות אחרות דפוס על משטחי חומר. אנו מדגימים את השלבים הבסיסיים של תהליך זה, ביול דפוסים של פיברונקטין על זכוכית.
Abstract
היכולת חלבונים דפוס ביומולקולות אחרים על גבי מצעים חשוב לתפוס את המורכבות של הסביבה המרחבית תאיים. פיתוח והדפסה microcontact ידי קבוצת Whitesides (
Protocol
1. ההכנה של פתרונות וחומרים
פעולות אלה צריכות להתבצע מספר ימים מראש.
- זכוכית coverslips. Coverslips נוקו על ידי טבילה למשך 10 דקות לתוך תמיסה של חומר ניקוי 7x Linbro: מים, מעורבות בבית 1: 3 יחס ומחוממת, עם ערבוב, עד ברור. Coverslips היו שטופים נרחב עם מים deionized, אפויים אז במשך 6 שעות על 450 מעלות צלזיוס. טוען coverslips לתוך מתלים מכתים קרמיקה (ראה ריאגנטים) פשוט התהליך הזה.
- חלבון פתרון ביול. מחדש פיברונקטין ההנחיות ליצרנים פתרון המניות של ריכוז מ"ג / מ"ל 1.
2. מבצע בולים מן האדון טופולוגי
צעדים אלה יכולים להתבצע מספר ימים מראש. חנות בולים דפוס-up בצלחת מכוסה, כגון צלחת בתרבית רקמה.
- הסרת אבק משוחרר מן האדון באמצעות זרם של דחוס, אוויר מסונן או גז אינרטי.
- המקום, מאסטר בצד בדוגמת למעלה, בחלק התחתון של צלחת פלסטיק פשוט גדול יותר לשלוט. 60 - או 100 מ"מ תרבות מנות רקמה מתאימים היטב למטרה זו.
- בתוך צינור 50 מ"ל פוליסטירן צנטריפוגות, לשלב את רכיבי Sylgard ביחס של סוכן ריפוי: בסיס אלסטומר של 1: 10 לפי משקל. מערבבים היטב בעזרת מכשיר פלסטיק, כגון טפטפת הפנויה. הכן לפחות 0.2 מ"ל של אלסטומר לסנטימטר מרובע של שטח צלחת.
- צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב G 300 דקות 5 להסיר בועות אוויר.
- יוצקים את אלסטומר על המאסטר, אז מקום ייבוש, תחת ואקום, במשך 30 דקות.
- Cure אלסטומר בתנור על 65 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. אשפרה בטמפרטורות גבוהות ועל פי התוצאות כבר אלסטומר נוקשה. בואו להתקרר לטמפרטורת החדר.
- הפרד את גיליון הבולים מן האדון.
3. Microcontact הדפסה של פיברונקטין על זכוכית
- לגזור חותמת אחת. בולים מדידה 4 מ"מ x 4 מ"מ עד 1 ס"מ X 1 ס"מ באזור ו 1-2 מ"מ עובי הם הקלה ביותר להתחיל עם. מניחים בצד עד דפוס בשקופית זכוכית או צלחת פלסטיק קטנה.
- המקום בול שואב פלזמה, תהליך, תחת ואקום, למשך 30 שניות. מדעי Harrick מנקה פלזמה (ראה ציוד), נקבע על הגדרת הגבוהה ביותר הפלט יציג את פני השטח PDMS הידרופילי. כבר פעמים לגרום פיצוח של אלסטומר.
- לדלל את הפתרון פיברונקטין עם מים deionized לריכוז הטבעה של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
- המקום טיפה קטנה (10-50 μl) של הטבעה פתרון הבול. זה יתפשט על פני השטח הידרופילי. הוסף רק פתרון מספיק כי ירידה מכסה את החותמת, אבל לא לדרוס את הקצוות. בואו לספוג חלבון חותמת במשך 5 דקות.
- באמצעות ® Kimwipe או נייר אחר רקמות נקייה, הפתיל את רוב הפתרון חלבון מן הבול, בלי לגעת באזור בדוגמת.
- יבש הפתרון שנותר חותמת תחת זרם של גז נקי, יבש, אדיש, כגון חנקן.
- בעזרת פינצטה, להסיר את חותמת משקופית הזכוכית, להפוך, ומקום במגע עם coverslip הזכוכית לנקות (את פני השטח להיות בדוגמת). מניחים משקל על גבי לקדם קשר טוב. משקל סגולי המספק את דפוסים הטובה ביותר תלויה בגודל בול דפוס; להתחיל עם משקל 5 גרם, ולהתאים בין stampings. השאירו חותם על קשר עם השטח עבור 1 דקות.
- בזהירות לפרק את הערימה, חותמת נפרדת coverslip.
- בתוקף לשטוף את coverslip בדוגמת ב-PBS, ואחריו מים deionized, להסיר חלבון שאינו adsorbed אל פני השטח. Coverslip יבש תחת זרם חנקן.
נציג תוצאות
הדפסה Microcontact הוא תהליך רב עוצמה עבור דפוסים מולקולות על משטחים. תהליך זה יש את היכולת ליצור תכונות עם ממדים החל עשרות מיקרומטר עד מאות ננומטרים; באיור. 1A, את הלוגו בצד שמאל נמצאים כל 200 מיקרומטר גובה, בעוד כתמים ירוקים מאויר באיור. 1B הם 1 מיקרומטר בקוטר במרווחים של 4 במרווחים מיקרומטר, נמדד מרכז אל מרכז. איור. 1B גם ממחיש מאפיין עוצמה של הדפסה microcontact, כלומר שזה תהליך כתוסף. מספר סיבובים של הדפסה microcontact יכול להיות מיושם על פני אחד כדי ליצור multicomponent מערכות 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תהליך ההדפסה microcontact היא פשוטה מבחינה מושגית חזקים מאוד, לאחר הוחל על דפוסים מגוון רחב של מולקולות על מגוון מצעים. עם זאת, תהליך זה נשאר משהו של האמנות. הגיאומטריה מסוים של דפוס להיווצר, חלבון להיות בדוגמת, משקל מוחל, ציפוי / הטבעה כל התנאים להשפיע על איכות הטבעה. לדוגמה, גם משקל קטן, ליישם תכונות גדולות, לעתים קרובות תוצאות פערים דפוס כפי שניתן לראות בלוגו הימנית העליונה של איור. 1A. לעומת זאת, משקל רב מדי יגרום נפול וקריסה של הבול, וכתוצאה מכך בתצהיר מכוון של חלבון באזורים בין בדוגמת features.As דוגמה שנייה, חלבונים ספציפיים (כמו נוגדנים) דפוס עם איכות טובה יותר אם הצעד טיפול פלזמה מושמט, עוזב PDMS הידרופילי. הטבעה של פיברונקטין על זכוכית מוצג כאן כנקודת פתיחה לשינויים ו אופטימיזציות כאלה, הוכחת את הטכניקות הבסיסיות של תהליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
